2024年4月10日发(作者：)

Oligo使用方法介绍

作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要

功能：如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。

在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不

同的实验情况，导入模板有三种方法：

1， 直接用键盘输入：

a， 点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，

进入序列展示窗口；

b， 此时即可键入DNA序列；

c， 如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。点

击Edit菜单中的“Readback on”即可。

2， 利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文

件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序

列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后，点击

Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。

3， 如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序

列文件。

点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。

进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温

度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它

的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所

设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，

该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。

一，普通引物对的搜索：

以Mouse 4E（cDNA序列）为例。我们的目的是以Mouse 4E（2361 bp）为模板，设计一对

引物来扩增出600－800bp长的PCR产物。

1，点击“Search“菜单中的”For Primers and Probes“命令，进入引物搜索对话框；

2，由于我们要设计的是一对PCR引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatible

pairs。

在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：a，无二聚体；b，3’端高度特异，GC含量

有限定，d，去除错误引发引物等。

3，剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。

①单击：“search Ranges”按钮，弹出“Search Ranges”对话框。输入上游引物的范围：1－2000，

下游引物的位置：100－2300；PCR产物的长度600－800bp。

②单击“Paramaters”按钮进入“Search Parameters”对话框，对话框种分三个活页，分别是：不

同设定，参数以及更多参数。

③在“普通设定”窗口，为我们提供了对引物非常直观的设定方法，从高到低分六个等级，最

后还有一个用户定制选项。

④当我们对引物的各种参数的含义及应该设定多大值并不是特别清楚时，就可以直接设定

Very high/High等来完成对引物设计参数的设定。

⑤当我们选中“Automatically Change String”后，Oligo会在引物搜索过程中：如果在高等级

设定中无法找到引物对时自动降低一个定级来进行搜索，知道找到引物对。在设计反向PCR

引物对时，就选中“Inverse PCR”复选框。

⑥我们还可以让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE？（Prime Effitions，引发

效率）。也可以限定所选引物对的最大数目。

⑦在“Parameters”窗口中，实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据试验的要求作相应

的改变，如23nt。其他参数就使用Oligo的默认值，一般无需改变。在“More Parameters“窗

口中，一般也无需作任何改变，直接用Oligo的默认值。

4，点击“确认”－“Ok”进入搜索窗口，再次单击“OK”后，Oligo自动完成引物对的搜索，并

出现一个搜索结果窗口。显示出得到的引物对数目。

5，点击“Ok”，出现“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7对引物的简单信息，引物位置，

产物长度，最佳退火温度及GC含量。单击“Sort”按钮，可以按产物长度，最佳退火温度及

GC含量从小到大或从大到小的顺序排列。

6，点击任意一对引物，在旁边马上弹出一个叫“PCR”的窗口，在窗口中我们可以看到这对

引物在模板中的大概位置，最佳退火温度（该温度可以直接应用于我们实际PCR中的第二

步退火）。另外还有引物的Tm值，GC含量，引发效率，同时还计算出了产物的Tm值于引

物Tm值的差异以及引物间Tm值的差异。一般我们尽量保持前者在20度以内，后者在5

－6度以内。点击不同的引物对时，PCR窗口内容同时作相应的改变。

7，要想了解引物的详细信息，如二聚体，发卡结构形成情况、组成、Tm值和错误引发位

点等，这时只需点击“Analyze”菜单中的相应命令，就可以分别得到相关信息。例如点击

“Duplex Formation”，我们就可以得到上游引物间，下游引物间及上下游引物间形成二聚体

的情况。同理，“Hairpin Formation”，“Composition and Tm”，“False Priming Sites”等命令就

可以显示出相关信息。所有这些分析的结果都有助于我们从Oligo搜索得到的多对引物中选

择最佳的引物对。

需要说明的是，1，如果一次搜索得到的引物对太多时，我们可以适当提高选定的条件和规

定更合适的搜索范围来减少引物对数；2，引物一般尽量不要在3’端或是离3’端太近的位置

形成二聚体，同时二聚体的自有能绝对值尽量小于10；3，对于错误引发，在普通PCR中，

如果引发效率在160 points以上时，就可能出现杂带，在测序反应中，错误引发效率则应该

严格控制在120 points以下。

8，Oligo中每对引物的详细信息可以直接导出为一个文本文件：

首先点击“File”菜单中的“Print/Save Options”，在出现的对话框中的普通设定选中“Selected”；

在“Analyze I”中选择需要保存的信息，在“Analyze II”中选中PCR。

单击确定按钮退出，这时再次点击“File”菜单，Save浮动命令中的“Data Save as”，选择路径

及文件名即可。

二，测序引物的设计：

在oligo中，测序引物设计过程与普通引物设计大部分都很相似。

还是以Mouse 4E为例，假如我们要在600－800bp的位置设计一条测序引物。

Open－Search

在“Search”窗口中，选中“Sequece Primer”，同时去除负链Search的选中

在“Search Range”窗口，输入正链的600－800bp

在“Parameters”中选定 very high ，引物长度改为18bp

结果得到11条测序引物，与普通引物同理，根据其详细信息就可以挑选到一条最佳的测序

引物。

三，探针的设计：

探针的设计与测序引物设计基本相同，只需使“Search”窗口的探针设计选中，改变探针的长

度就可以。

四，评估引物对：

我们在各种文献中查到的引物，如果直接进行PCR，往往很难重复别人的实验结果。这时

就想到，是不是引物的质量有问题？能不能用软件来对这些问题引物进行一些分析呢？答案

时肯定的。

1，点击File菜单中的New命令；

2，在“Edit New Sequence”的窗口中用键盘输入上游引物；

3，如果该引物的首位置不是1的话，可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字，如20；

4，点击Accept/Discard菜单的Accept命令；

5，如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度；

6，选取当前序列为上游引物（点击“upper”按钮）；

7，从Edit菜单中选取“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列；

8，在Edit窗口的上角处，输入相应的5’位置；

9，选取“Accept and Quit”命令；

如果想让程序给出最佳退火温度，在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所

占百分比，一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44％。

10，点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。

心得

yvette wrote:

对于作PCR的来说，最难的莫过于设计引物了，理论现在已经很多了，但是真正实践起来

是要付出一定的心智的，记得曾经看到某一位主任说他设计了上千对引物，从没有失手的时

候，真是让我佩服得五体投地。

最近看了一下OLIGO6.0的使用说明，英文的，感觉有很多地方还是讲得不很明白，比如

Nested primers design 及 multiplex PCR Primer design.

下面我先来讲讲普通的利用OLIGO 设计引物的方法吧：

1 从文件菜单打开模板序列，当然，不是随便什么序列都可以打开的，要有特定的格式，一

般扩展名为 *.seq的序列可以直接打开，或者就从文件菜单选择new sequence打开一个空窗

口，然后利用复制/粘贴也可以导入模板序列，或者直接在该窗口中写，然后要打开文件菜

单旁边的 accept 菜单，选accept就可以了；这时候有三个窗口，重叠在一起，很不方便看，

可以从window菜单选Tile，这样，三个窗口就平行排列了。

2 从search菜单选primers and probes，打开了引物搜索窗

3 点黑PCR下面的compatible pairs 前面的小圆孔

4 在oligonucleotide with GC clamp 及 Eliminate false priming 前的小方格里打上勾

5 如果在PCR中可能存在其他的模板，要想使所设计的引物与该模板不会形成错配，可在

And continue above search in other files 的条目前方格中打勾，这时会出现一个新的 select

files窗，导入可能会形成错配的模板序列。点OK

6 点Search ranges按钮，输入你想要的上游和下游引物在模板序列上的区间及想要的产物

的长度，点OK

7 点parameters 即引物参数按钮，一般将搜索严谨性设为high，如果搜不到，再降低严谨

性，另外，在adjust length to match Tm's前的方格中打勾。点OK

8 点击OK开始自动搜索

9 搜索完成后，在search status窗口的下部选show:primer primers, 点OK

10 得到的引物可以根据位置、长度、退火温度及GC含量进行排序（sort)

11 点击您所想要的就打开了一个窗口显示引物的位置、退货温度、GC含量、PE(Priming

efficiency 引发效率)等。

12 从文件菜单点击"New Database" ，然后从import菜单点击 upper primer 和lower primer

就可以将您所需要的上下游引物序列导入到数据库中，至于如何生成引物报告单我就不甚了

了，感觉这个功能不如primer premier好使。还希望知道如何使用的兄弟不吝赐教一下叻。

Nested Primer pairs Search

与上述自动搜索差不多，有一下几点不同：

1 打开search菜单后，不要选定 “ And continue above search in other files ”

2 打开parameters菜单后，注意不要选定“ Inverse PCR” 框 ，同样选定“adjust length to match

Tm's” 框

3 开始搜索后得到结果显示在“Primer pairs"窗口中，从analyze菜单中 选定multiplexing,得

到一个显示所有搜索到的引物在模板上的位置的窗口，直接在该窗口中选择您所要的引物，

在您所要的引物的小方块上点击一下，positive strand primer 选定后就从红色变成了绿色，

negative strand primer 选定后就从蓝色变成了绿色。先选择巢式PCR的一对外引物，然后选

择一对内引物，选定后点击pairs就打开了显示您所选定引物的窗口

4 从文件菜单点击"New Database" ，然后从import菜单点击multiplexed primers就将您所选

定的引物导入到一个数据库中，保存。

好像从export 菜单可以生成order form, 但是我实在是太木了，这都大功告成了，到了最后

又歇菜了。

还有很重要的功能如搜寻 consensus primer pair 和搜寻 unique primer pair 来扩增同源性的

模板，比如后一个应该就是设计扩增许多同源性很高的序列的保守区吧，我以为我已经找到

了尚方宝剑了，可是三条序列试了一下，这三条序列经过 multiple align后有很长一段是保

守的，您猜怎么着，等了好几分钟，结果没有找到，我又用十条序列，干脆就死机了，可能

这一功能需要很大的内存才能使用。也许是我还没有找到窍门，有知道的还请教教我。