2024年4月10日发(作者：)

测序引物设计指南

♦PCR引物设计方法：

1。引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的

同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对(Alignment），各基因相同的序列就

是该基因的保守区。

2。引物长度一般在15～30碱基之间。

引物长度(primerlength）常用的是18—27bp，但不应大于38,因为过长会导致其延

伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应.

3。引物GC含量在40%~60％之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量(composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能

相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度,

即在一定盐浓度条件下，50％寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5～

10℃。若按公式Tm=4（G+C)+2（A+T）估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55～80℃，

其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简

并,会影响扩增的特异性与效率。

5。引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使

在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，

G和C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6。碱基要随机分布.

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列,否则容易

导致错误引发（Falsepriming).降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分

布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在.尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因

这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物

本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连

续4个碱基的互补.

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer

与Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4。

5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正

常进行。

8。引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。

△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳

定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较

低（绝对值不超过9)的引物.引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发

DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）

9。引物的5′ 端可以修饰,而3′ 端不可修饰。

引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大.因此，可以被修饰

而不影响扩增的特异性.引物5′ 端修饰包括：加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+

等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序

列等。

引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构

可能.

10。扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时最好避

开二级结构区域。用有关软件(比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，

有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能（△G°）小于58。6lkJ/mol时，扩增往往不

能成功.若不能避开这一区域时，用7-deaza—2′—脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是

有帮助的。

11。引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就

可以进行下一步的实验了。

值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如

GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因

为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低.在这种情况只能退而求其次,尽量去满足

条件。

做RealTime时，用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上

所要求的参数是不同的。

♦总结：

1)避免重复碱基，尤其是G。

2）Tm=58-60度.

3）GC=30—80%。

4)3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

5）正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

6)PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大，一般在80—250bp之间都可;80～

150bp最为合适（可以延长至300bp）.

7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在.而且引物设计时应该考虑到引

物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子

的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都应该可以的。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有

从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备-—-寻找合适的引物非常不容易。

关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在

GENEBANK中公开的不物种基因序列当中,除了和你的目标基因之外,还有没有和其他物种

或其他序列当中存在相同的序列,如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其

他序列的产物,那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。