利用一步克隆方法快速高效构建Gateway入门载体

2024年4月12日发(作者：)

利用一步克隆方法快速高效构建Gateway入门载体

张艳军; 赵利; 李雨佳; 赵江哲; 张可伟

【期刊名称】《《浙江师范大学学报（自然科学版）》》

【年(卷),期】2020(043)001

【总页数】5页(P72-76)

【关键词】入门克隆; SLIC技术; Gateway; LR重组反应

【作 者】张艳军; 赵利; 李雨佳; 赵江哲; 张可伟

【作者单位】浙江师范大学 化学与生命科学学院 植物遗传发育研究所 浙江 金华

321004

【正文语种】中 文

【中图分类】Q785

在研究植物基因功能时，常常需要探究某个基因的时空表达模式、亚细胞定位和互

补表型，这就需要研究人员构建多个不同的表达载体，包括GUS融合表达载体、

GFP融合表达载体和35S过表达载体等[1].目前大多采用传统的酶切连接法构建这

些载体，不同的表达载体可能需要使用不同的酶切位点，整个构建过程需要多个步

骤，费时费力.而Invitrogen公司开发的Gateway技术以λ噬菌体的位点特异重

组系统为基础[2]，首先将扩增的PCR片段构建至Gateway入门载体，然后就可

以通过LR反应(一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应)将目的

片段从入门载体转移至不同功能的Gateway目的载体.LR重组过程简单快速，同

时保持DNA片段的阅读框和方向不变，从而大大提高了实验效率[3].目前

Invitrogen公司开发了多种可供选择的Gateway目的载体，包括用于体外表达的

pEXP2-DEST载体、大肠杆菌表达载体pDEST17、酵母表达的pYES2-DEST52

等.此外，研究人员也开发了很多与Gateway技术兼容的植物表达载体系统，如

Curtis等[4]构建了与Gateway技术兼容的农杆菌双元表达载体，可用于植物基因

研究，包括用于蛋白质的亚细胞定位和基因互补试验等相关载体.

利用Gateway技术构建目的载体时,首先需要将目的基因构建至入门载体.目前构

建入门载体主要有3种方法：1)通过BP反应(一个attB DNA片段或表达克隆与

一个attP供体载体之间的重组反应)将PCR片段重组到pDONR[5]和pENTR等

入门载体，这些载体可以重复使用，但是BP重组酶价格昂贵，而且插入片段大于

2 kb时，效率会大大降低；2)利用TOPO克隆或TA克隆方法将PCR产物连接到

pENTR/D-TOPO[6]和pCR8/GW/TOPO等入门载体，但这些载体价格昂贵，且

不能够复制和反复使用，大大增加了实验成本；3)利用限制性内切酶将PCR片段

连接到入门载体，如GEC和PEC载体[7]，该方法成本低廉，但是常受限于载体

上的酶切位点位置，并且耗时过长.

为了解决上述这些问题，充分利用Gateway技术兼容的植物表达载体系统，本研

究开发了一种快速高效低成本构建Gateway入门载体的方法，对于推广Gateway

技术有着重要意义.本研究以实验室保存的pCR8-AtS5H入门克隆载体和水稻异分

支酸合成酶基因的启动子(ICS1pro)片段为例，对该方法进行详细阐述.首先利用限

制酶EcoR Ⅰ对pCR8-AtS5H入门克隆进行单酶切，并回收pCR8片段，将其作

为入门载体；然后扩增并纯化ICS1pro片段，并利用一步SLIC法[8]将纯化后的

ICS1pro片段构建至pCR8入门载体，通过菌落PCR和测序方法鉴定得到阳性入

门克隆；最后通过LR反应将入门克隆中ICS1pro片段构建至目的载体

pMDC163.这种利用不依赖序列和连接的克隆方法快速构建Gateway入门载体的

方法操作简便，同时成功率高且成本很低，是一种有广泛应用前景的Gateway入

门载体构建方法.

1 材料和方法

1.1 材 料

水稻日本晴DNA、大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α、质粒pCR8-AtS5H和

Gateway目的载体pMDC163均由本实验室保存，其中pCR8-AtS5H质粒是利

用TOPO克隆方法将拟南芥S5H基因构建至pCR8/GW/TOPO载体(购自赛默飞

世尔科技(中国)有限公司)而获得的入门克隆.KOD FX购自东洋纺(上海)生物科技有

限公司；2×Taq Master Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司；限制性内切酶

EcoR Ⅰ购自宝生物工程(大连)有限公司；T4 DNA聚合酶购自New England

Biolabs(北京)有限公司；LR重组试剂购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；质粒

提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 引物设计

根据pCR8载体和水稻异分支酸合成酶基因(LOC_Os09g19734)的启动子DNA序

列设计扩增引物，分别为ICS1pro-F1：

GCAGGCTCCGAATTCTGGCTTGGGTAGGATTATG和ICS1pro-R1：

AAGCTGGGTCGAATTCCGGGTGGGAGGAGGAAGAAG，其中划线部分(15或

16 bp)为pCR8载体片段两端同源序列.此外，根据水稻异分支酸合成酶基因的启

动子(ICS1pro)序列设计菌落PCR引物，分别为ICS1pro-F2：

TTGGCTTGGGTAGGATTA和ICS1pro-R2：ACGAAGGAGCGAAGGTTA.上述引

物均由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成.

1.2.2 ICS1pro片段的扩增与纯化

以CTAB方法提取的日本晴DNA为模板进行基因扩增.PCR反应体系为(总体积

50 μL)：2×KOD FX PCR缓冲液25 μL，2 mmol/L dNTP 10 μL，10 μmol/L引

物ICS1pro-F1 1.5 μL，10 μmol/L引物ICS1pro-R1 1.5 μL，KOD FX 1 μL，

DNA 1 μL，ddH2O 10 μL.反应条件为：94 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s,55 ℃

退火30 s，68 ℃延伸3 min，共30个循环；68 ℃延伸10 min.基因扩增完成后

进行琼脂糖凝胶电泳，切胶利用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物.最后使用20 μL

10 mmol/L Tris·HCl(pH 8.0)洗脱.

1.2.3 pCR8片段的获得

利用限制性内切酶EcoR Ⅰ对质粒pCR8-AtS5H进行单酶切，反应体系为：

10×H缓冲液5 μL，EcoR Ⅰ 2.5 μL，pCR8-AtS5H质粒(100 ng/μL)20 μL，

ddH2O 22.5 μL；37 ℃下酶切1～3 h.酶切时间长短取决于EcoR Ⅰ酶活性，在

保证酶切效果(完全酶切)的同时，应尽可能缩短酶切时间，避免造成星活性.酶切产

物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并利用胶回收试剂盒纯化回收 pCR8片段(大小为

2.8 kb).最后使用20 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)洗脱，测定浓度，将浓度调

整到大约30 ng/μL.

1.2.4 pCR8-ICS1pro质粒的构建

利用一步SLIC法将回收的ICS1pro片段和pCR8片段进行连接，其反应体系为：

10×NEB缓冲液2.01 μL，100×BSA (NEB)0.1 μL，ICS1pro片段(80 ng/μL)3

μL，pCR8片段(30 ng/μL)4 μL，ddH2O 1.9 μL，T4 DNA聚合酶(NEB)0.2

μL(最后加入)，其中ICS1pro片段和pCR8片段物质的量的比为2∶1.上述混合液

在加入T4 DNA聚合酶后立即置于PCR仪中26 ℃下孵育2.5 min，然后立即将

其置于冰浴中10 min，然后取2 μL反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态(热激

法)，最后涂板至含有壮观霉素(80 mg/L)的LB培养基平板.此外，首次使用回收的

pCR8片段时，应取相应量的pCR8质粒片段单独转化大肠杆菌DH5α作为负对

照，用于检验1.2.3 方法中pCR8-AtS5H质粒的酶切效果.如果负对照转化不长斑

或仅长几个斑，则获得的pCR8载体片段可用于质粒构建.此外，该步骤的重组反

应也可以使用其他商品化的无缝克隆试剂盒替代.

1.2.5 pCR8-ICS1pro质粒的菌落PCR验证和测序

随机挑取6个单菌落进行菌落PCR验证，其PCR反应体系为：2×Taq Master

Mix 5 μL，10 μmol/L引物ICS1pro-F2 1 μL，10 μmol/L引物ICS1pro-R2 1

μL，ddH2O 3 μL.反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s,55 ℃退火

30 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环；72 ℃延伸10 min.根据菌落PCR结果，

提取阳性克隆质粒，并送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序.测序引物为

通用引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和

M13R(CAGGAAACAGCTATGACC).

1.2.6 LR重组反应

将pCR8-ICS1pro质粒和pMDC163质粒(含有ccdB自杀基因)浓度分别调至

150 ng/μL，LR重组反应体系为：pCR8-ICS1pro 1 μL，pMDC163 1 μL，LR

Clonase II enzyme 0.5 μL.25 ℃孵育1 h后，加入0.25 μL蛋白酶K溶液，混匀

后置于37 ℃培养箱反应30 min，然后取1 μL反应产物转化大肠杆菌DH5α感

受态(热激法)，最后涂板至含有卡那霉素(50 mg/L)的LB培养基平板.

1.2.7 pMDC163-ICS1pro质粒的菌落PCR验证和测序

随机挑取4个单菌落，按照1.2.5方法进行菌落PCR验证，获得pMDC163-

ICS1pro阳性克隆，并提取质粒送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序.测

序引物为公共引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT).

2 结果与讨论

2.1 ICS1pro片段扩增

以日本晴DNA为模板，按照1.2.2方法成功扩增得到ICS1pro的片段，如图1所

示.PCR产物大小约3.00 kb左右，与目标片段大小(2.89 kb)相符.对扩增产物进行

纯化回收，洗脱时使用20 μL的10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0).

1：ICS1pro PCR扩增片段；M：DNA分子标记图1 ICS1pro DNA片段扩增结

果

2.2 pCR8片段的获得

按照1.2.3方法对实验室保存的pCR8-AtS5H质粒进行单酶切，其电泳结果如图

2所示.pCR8-AtS5H酶切后产物大小分别为3.00 kb和1.10 kb左右，与理论预

测的片段大小相符，其中3.00 kb左右的条带为pCR8片段，利用胶回收试剂盒

对其割胶产物进行回收，洗脱时使用20 μL的10 mmol/L Tris·HCl(pH 8.0).

1:pCR8-AtS5H 的EcoR Ⅰ酶切后产物；M:DNA分子标记图2 质粒pCR8-

AtS5H的EcoR Ⅰ单酶切结果

2.3 pCR8-ICS1pro入门克隆的构建

按照1.2.4方法对回收的ICS1pro片段和pCR8片段进行连接和转化，并按照

1.2.5方法对pCR8-ICS1pro质粒进行菌落PCR验证，其结果如图3所示.6个菌

落PCR产物均与阳性对照大小一致，提取1号菌株质粒并送样测序，测序结果显

示其序列与水稻中ICS1pro序列完全一致，因此该克隆即为pCR8-ICS1pro入门

克隆.

M:DNA分子标记；1—6:菌落PCR产物；7:阳性对照；8:阴性对照图3 pCR8-

ICS1pro质粒的菌落PCR鉴定结果

2.4 pMDC163-ICS1pro目标载体的构建

按照1.2.6方法对pCR8-ICS1pro质粒和pMDC163质粒进行LR重组反应，并按

照1.2.7方法进行菌落PCR鉴定，其结果如图4所示.4个菌落PCR产物均与阳性

对照大小一致，提取1号菌株质粒并送样测序，测序结果显示其序列与水稻中

ICS1pro序列完全一致，因此，该克隆即为pDMC163-ICS1pro入门克隆.该结果

表明，利用一步SLIC方法构建的Gateway入门载体完全可用于目标载体的构建.

M:DNA分子标记；1—4:菌落PCR产物；5:阳性对照；6:阴性对照图4

pMDC163-ICS1pro质粒的菌落PCR鉴定结果

3 讨 论

Gateway技术使载体构建更加的方便和快捷，一旦获得了目的基因的入门克隆，

就可以非常高效地将目的基因转移到各种Gateway目的载体中[9].目前该技术被

广泛用于蛋白表达、蛋白质亚细胞定位、基因文库构建、基因沉默、启动子分析及

基因功能研究等[10-12].例如，范芳芳等[13]通过重叠PCR 技术扩增出AttB-TEV-

FLAG-AIK 序列，利用 BP 重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK 克隆至供体载体

pDONR223中，再通过 LR 重组反应将目的序列转移到目的载体pDEST15中，

从而得到GST-AIK 融合蛋白原核表达质粒，实现了GST-AIK 融合蛋白的高效可

溶性表达，经亲和层析获得了有生物活性的重组 AIK 多肽，为后续深入研究和大

规模制备奠定了基础.

虽然Invitrogen公司提供了多种入门载体系统和构建入门克隆的方法，但均存在

一定的局限性，且成本相对较高[14]，从而影响了Gateway技术的大范围应用.因

此，科研人员尝试建立一种简便快速的构建入门克隆的方法.例如，通过对入门载

体 pDONR207 进行改造，使其变成一个含有2个Xcm Ⅰ酶切位点和ccdB自杀

基因的环状入门载体，经Xcm Ⅰ酶切后即可产生3′端具有单个T末端的线性化入

门载体，再通过简单的TA连接方法即构建入门克隆，从而替代了原先较昂贵的

BP反应[15].此外，孙全喜等[16]提供了另一种环状入门载体pRMG-C，该质粒含

有Sal Ⅰ,Sac Ⅰ,Sph Ⅰ,BamH Ⅰ,Hind Ⅲ,Xho Ⅰ,Pst Ⅰ,Kpn I,EcoR Ⅰ等多个常

用限制性酶切位点，可以方便基因的酶切-连接克隆，同时改造后的入门载体为环

状质粒，可以自行保存和制备，大大降低了实验的成本.

虽然这些改造后的入门载体降低了构建入门克隆的成本，但仍然存在一些缺点，例

如TA连接存在非定向克隆的缺点，需要利用PCR方法鉴定片段的插入方向[17].

本研究建立了一种利用一步SLIC方法快速构建Gateway入门载体的方法，该方

法具有诸多优点：1)非常省时，2.5 min即可完成连接，而BP反应则需要1.5 h；

2)利用实验室保存的入门克隆来获得入门载体片段，而且该入门克隆可以保存和反

复使用，因此，实验过程中不需要购买昂贵的入门载体(20个反应试剂盒价格高达

5 712.0元)，同时该方法所用的其他试剂成本也非常低，单个反应所用T4 DNA

聚合酶成本仅约2.8元，而单个BP反应成本高达134.8元.因此，本方法可以大大

降低构建入门克隆的实验成本(以pCR8-AtS5H入门克隆为例，但其他任何含有合

适酶切位点的入门克隆都适用于该方法)；3)所利用的一步SLIC技术是一种不依赖

序列和连接的克隆方法，不受酶切位点限制，同时连接效率非常高，也不存在TA

连接的非定向克隆问题.

目前实验室利用该方法成功构建了几十个pMDC系列的Gateway目的载体.LR重

组效率取决于目的片段大小、LR酶活性和感受态转化效率等，大多在10～30个

菌落/ng的目的载体，与原始pCR8/GW/TOPO载体重组效率相当.总之，本研究

建立的利用一步SLIC技术构建入门克隆的方法操作非常简单、效率高且成本低，

是一种非常值得推广的构建Gateway入门克隆的新方法.

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