逆转录病毒方法建立小鼠诱导性多能干细胞的实验研究

2023年12月29日发(作者：)

逆转录病毒方法建立小鼠诱导性多能干细胞的实验研究

单威;余勤;王标;刘丽珍;刘森泉;付珊;刘伟;周丽萍

【摘 要】[目的]采用逆转录病毒法转染P2代ICR的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse

embryonic fibroblast,MEF),建立小鼠诱导性多能干细胞(induced pluripotent

stem cell,iPS cell,iPS细胞).[方法]本实验采用293T细胞进行逆转录病毒包装,将分别携带来源于人的Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4转录因子的4种逆转录病毒液共转染ICR小鼠的MEF,并在转染过程中添加维生素C、丙戊酸钠来提高小鼠iPS细胞的诱导效率,通过碱性磷酸酶染色、RT-PCR方法检测建立的细胞株.[结果]转染的MEF在1周左右时间出现明显克隆,克隆传代的细胞经碱性磷酸酶染色呈紫红色,RTPCR检测结果显示细胞株中的Oct3/4、Sox2 、c-Myc、Klf4、Nanog 5种多能性相关的基因都得到明显表达.[结论]转染的MEF在1周左右时间出现明显克隆,小鼠iPS细胞的一些表面标志如碱性磷酸酶得到表达,Oct3/4、Sox2、c-Myc 、Klf4、Nanog 5种多能性相关基因也都得到明显表达,表明已经建立小鼠iPS细胞.

【期刊名称】《浙江中医药大学学报》

【年(卷),期】2013(037)002

【总页数】5页(P111-115)

【关键词】iPS细胞;MEF;逆转录病毒

【作 者】单威;余勤;王标;刘丽珍;刘森泉;付珊;刘伟;周丽萍

【作者单位】浙江中医药大学生物工程学院 杭州 310053;浙江中医药大学生物工程学院 杭州 310053;浙江中医药大学生物工程学院 杭州 310053;浙江大学医学院

附属第一医院;浙江大学医学院附属第一医院;浙江大学医学院附属第一医院;浙江中医药大学生物工程学院 杭州 310053;浙江中医药大学生物工程学院 杭州 310053

【正文语种】中 文

【中图分类】R331

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES cell，ES 细胞）是从哺乳类动物囊胚的内细胞团中培养获得，维持全能性的同时还具有无限增殖的能力，并且具有分化成三胚层细胞的能力，从而在再生医学、干细胞治疗、个性化药物筛选方面起着重要作用，但其在应用中涉及到伦理及免疫排斥问题。诱导性多能干细胞（induced

pluripotent stem cell，iPS cell，iPS 细胞）是利用细胞重编程技术将体细胞重编程为类似于ES细胞的一种多潜能干细胞，从而规避了ES细胞在应用中涉及到的问题。

目前国内外研究者在不断探求各种建立iPS细胞的方法。iPS细胞诞生于2006年，Takahashi和Yamanaka[1]通过逆转录病毒法，利用 Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4 4种转录因子转染小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）创建首批小鼠 iPS细胞，该成果于2012年10月获得诺贝尔生理或医学奖。2007年Takahashi等[2]利用逆转录病毒方法将MEF和尾部成纤维细胞诱导成小鼠iPS细胞，并对其过程进行详细阐述。2008年Shi等[3]利用 Oct3/4和 Klf4及一些小分子化合物将MEF诱导成iPS细胞。2011年Liu等[4]利用逆转录病毒方法将八周左右NOD小鼠的尾部成纤维细胞诱导成小鼠iPS细胞。Li等[5]利用Oct3/4及一些小分子化合物如丙戊酸钠（VPA）、维生素C建立小鼠iPS细胞培养体系。为提高iPS细胞重编程效率，在转染过程中可以添加小分子化合物，如VPA和维生素C等。Esteban等[6]研究发现维生素C可以提高人或小鼠iPS细胞

的诱导效率。本实验参照2006年Yamanaka等[1]人建立小鼠iPS细胞的方法，利用逆转录病毒携带Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4 4种转录因子转染未进行基因层面修饰的MEF，并在转染过程中添加了维生素C、VPA来提高小鼠iPS细胞的诱导效率。该项研究结果将为本课题组进行后续实验如小鼠iPS细胞向神经细胞分化研究等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 pMXs-hc-hSOX2质粒、pMXs-hc-hcMyc质粒、pMXs-hc-hOct3/4质粒、pMXs-hc-hKlf4质粒、pCMV-GP包装质粒、pCMV-G包装质粒（-Kuan Yee实验室赠送），高糖 DMEM（Gibco），胎牛血清（Gibco），谷氨酰胺（Gibco），非必需氨基酸（Gibco），0.25%胰蛋白酶（Gibco），聚凝胺（Millipore），维生素 C（Sigma），丙戊酸钠（Sigma），丝裂霉素 C（Sigma），293T细胞（上海酶联生物科技有限公司），碱性磷酸酶试剂盒（STEMGENT），RT-PCR 检测试剂盒（TAKARA），ICR孕鼠（受孕13～14d，上海斯莱克实验动物有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 293T细胞与MEF的培养 293T细胞培养基：90%DMEM高糖培养液、10%FBS、1%谷氨酰胺。293T细胞传代：将含有90%贴壁的293T细胞用0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化1min，按照1:3～1:5的比例进行传代。MEF的培养基：90%DMEM高糖培养液、10%FBS、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸。MEF获得及培养：取ICR小鼠妊娠13～14d，脱颈椎处死，取其胚胎，弃除头和四肢及脏器，后用PBS冲洗干净，将胚胎转移至5mLEP管中，弯剪剪碎，之后转移至离心管中并添加0.25%胰蛋白酶（不含EDTA），置于37℃培养箱消化8～10min。将消化的组织转移到培养瓶里面（一个胚胎对应一个T-25cm2培养瓶），加入培养液，置于培养箱中培养过夜，获得原代细胞。将获得的原代细胞传

代扩增培养。本实验采用P2代MEF建立小鼠iPS细胞，采用P3-P4代MEF作饲养层细胞培养小鼠iPS细胞。

1.2.2 饲养层细胞的制备 将P3-P4代MEF在明胶包被6孔板中培养，融合率达80%～90%后，丝裂霉素 C（工作浓度为 7μg·mL-1）处理 2h，用 PBS（不含Ca2＋、Mg2＋）冲洗 3～4 遍，作饲养层细胞。饲养层细胞尽可能制备好之后便用来培养iPS细胞，多余的可液氮中保存。

1.2.3 逆转录病毒的制备和小鼠iPS细胞的诱导 逆转录病毒的制备：293T细胞培养至80%～90%融合时进行逆转录病毒包装，包装前进行半量换液，用来源于人的 pMXs-hc-hSOX2，pMXs-hc-hcMyc，pMXshc-hOct3/4，pMXs-hc-hKlf4

4种目的质粒及pCMVGP、pCMV-G两种包装质粒通过磷酸钙沉淀法制备出分别携带 Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4 4 种转录因子的4份逆转录病毒，同时用能够表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的空载体包装病毒，用包装的病毒上清液转染MEF作以对照。小鼠iPS细胞的诱导：病毒包装好之后，48h后收取病毒上清液，之后向4个培养皿中分别加入5mL培养液（24h后再次收取病毒液，对MEF进行2次转染）。将4份病毒等体积混合并将病毒加入到含有60%～70%融合MEF的6孔板中，每孔加4mL的病毒液，再加入4μL的

4μg·μL-1的聚凝胺（终浓度为 4μg·mL-1）。每次病毒的转染时间为6～8h。每次转染之后将病毒液更换为MEF培养液。病毒转染完成后，培养基更换为小鼠ES细胞培养基，并向里面加入维生素C、VPA（维生素C的工作浓度为50μg·mL-1并且每天换液时需重新添加；VPA工作浓度为1mM并且第3d到第8d之间换液时需重新添加）。14d左右挑取iPS细胞克隆传代。

1.2.4 碱性磷酸酶染色法进行小鼠iPS细胞的表面标志检测 吸除6孔板中培养基，用2mL磷酸盐吐温缓冲液（PBST）冲洗两遍，添加2mL固定液，室温孵育2min吸除固定液，用2mL PBST冲洗1遍，吸除PBST，加入1mL新鲜备好的

碱性磷酸酶染液，用锡箔纸包裹，避光在室温保持10～20min，停止染色，用2mL PBS冲洗两遍，向里面添加适量PBS或培养基以防止细胞干燥，在显微镜下观察碱性磷酸酶表达结果。

1.2.5 小鼠iPS细胞多能性标志基因的RT-PCR检测 提取小鼠iPS细胞的总RNA进行检测，同时提取MEF的总RNA检测作以对照。反转录成cDNA后进行 PCR

检测。针对小鼠 Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog和GAPDH的基因序列设计引物，其中GAPDH为内参，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，PCR反应条

件见表1。

表1 PCR引物序列及反应条件Tab.1 PCR primer sequences and conditions变性Denature基因Gene引物序列Primer Sequences退火Annealing延伸Extension Oct3/4 TCT TTCCACCAGGCCCCCGGC TC TGCGGG CGG ACA

TGG GGA GATCC 72℃45s Sox2 TAG AGC TAG ACTCCG GGCGATGA TTG

CCT TAA ACA AGA CCA CGA AA 94℃30s 60℃30s 72℃45s c-Myc TGA

CCTAAC TCG AGGAGGAGC TGG AATC AAG TTTGAGGCA GTT AAA ATTATG

GCTGAA GC 72℃45s Klf4 GCG AAC TCA CACAGG CGA GAA ACC TCG

CTTCCTCTTCCTCCG ACA CA 94℃30s 60℃30s 94℃30s 60℃30s 72℃45s

Nanog CAGGTG TTTGAG GGT AGC TC CGG TTCATCATGGTA CAG TC

94℃30s 60℃30s 94℃30s 60℃30s 72℃45s

2 结果

2.1 荧光显微镜观察携带GFP空载体的逆转录病毒包装结果 荧光显微镜观察病毒包装48、72h之后的293T细胞，发现293T细胞中的GFP得到明显表达，说明携带GFP的逆转录病毒空表达载体（不含目的质粒）在进行病毒包装过程中成功转染到293T细胞中。见图1。

图1 荧光显微镜下显示病毒包装之后48、72h的携带GFP空载体的绿色荧光蛋白

表达情况（×40）Fig.1 Fluorescencemicroscope showed the green

fluorescentprotein expression of free-vectorwith GFP,after 48h,72h of

retroviral package(×40)注：A：病毒包装之后48h；B：病毒包装之后72h。Note:A:48h after virus package;B:72h after virus package.

2.2 携带GFP空载体的逆转录病毒转染MEF检测结果 分别收取病毒包装48、72h之后的病毒上清液转染目的细胞MEF，转染方法与携带有目的质粒的病毒上清液（不含有GFP表达基因）转染MEF方法相同。在光学显微镜下观察，发现MEF的生长状态良好；在荧光显微镜下观察，发现逆转录病毒中的表达基因GFP已经整合到MEF的基因组中，且在MEF中得到明显表达，说明本实验的逆转录病毒包装成功并能成功转染MEF。见图2。

图2 携带GFP空载体病毒转染MEF48～72h后，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达程度来评价病毒转染效果（×40）Fig.2 The transfection

efficiencywasestimated by evaluating the green fluorescentprotein

expression by fluorescencemicroscope,after 48-72h of retroviral

transfection(×40)注：A：光学显微镜观察病毒转染48～72h后的MEF形态；B：荧光显微镜观察病毒转染48～72h后的MEF形态。Note:A:MEF shape 48～72h after opticalmicroscope observing virus transfection;B:MEF shape 48～72h of fluorescent microscope abserving virus transtection.

2.3 iPS细胞形态学观察及结果 逆转录病毒转染MEF 2d后，第3d将培养基更换为小鼠ES细胞培养基。同时添加维生素C、VPA来提高iPS细胞的诱导效率。第5～6d，就有干细胞克隆出现，由于细胞本身不表达荧光，只能从形态上观察iPS的诱导形成过程。病毒转染14d左右，克隆长得足够大并将单个克隆挑取出来扩增培养，鉴定得到的1株iPS细胞。iPS细胞集落边缘清楚，表面光滑，结构致密，隆起生长，遮光性强，单个细胞体积大、核大核仁明显，无分化现象。见图3。

图3 病毒转染之后12d的iPS细胞克隆及培养的P1代小鼠iPS细胞（×100）Fig.3 The iPScell clone apparently emerged 12 days after virus transfection

and the amplified iPScell clonewas named as passage 1(×100)

2.4 小鼠iPS细胞的碱性磷酸酶染色结果 小鼠iPS细胞碱性磷酸酶染色为强阳性，光镜下观察克隆区域呈现紫红色，周边的饲养层细胞不能被染色。结果表明iPS细胞克隆表达碱性磷酸酶，而MEF不表达碱性磷酸酶。见图4。

图4 小鼠iPS细胞碱性磷酸酶染色结果（×40）Fig.4 Alkaline phosphatase

staining of iPScell(×40)

2.5 小鼠iPS细胞多能性标志基因的RT-PCR检测结果 通过RT-PCR检测小鼠iPS细胞多能性基因的表达情况，结果显示小鼠iPS细胞中的Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog 5 种多能性相关的基因都得到明显表达，而在MEF中没有得到表达。见图5。

图5 RT-PCR检测iPS细胞及MEF的干细胞多能性标志基因表达情况Fig.5 RT-PCR showed the expression ofpluripotencymarker genes

3 讨论

ES细胞在干细胞治疗、药物筛选及建立人的疾病模型等领域具有广泛应用价值，因此研究者们不断探求各种方法来获取人和不同物种的ES细胞。但ES细胞在应用过程中涉及伦理、免疫排斥、细胞来源、法律等诸多问题，这些问题的存在使得ES细胞在真正临床应用中受到严重阻碍。iPS细胞可以从人的体细胞中获得，并且其功能特性几乎与ES细胞一致，从而规避了ES细胞在临床应用中问题。故iPS细胞的诞生被誉为生命科学领域新的里程碑。

目前，通过逆转录病毒、腺病毒、质粒等介导的方式均可将转录因子对应的基因导入体细胞，将其重编程为iPS细胞[7]。MEF和成年小鼠尾部成纤维细胞甚至是小鼠骨髓单个核细胞等体细胞均可诱导产生iPS细胞，但MEF的诱导成功效率更高

一点[1-2,8]。本实验采用逆转录病毒法，将分别携带来源于人的Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4 转录因子的 4 种逆转录病毒液共转染MEF，最终建立iPS细胞。在建立小鼠iPS细胞系的同时，掌握体细胞重编程技术为后续实验奠定基础。

目前有多种方法在体外将体细胞重编程为iPS细胞，在早期的研究中，更多的需要对获得的iPS细胞进行筛选，对iPS细胞的筛选方法需要在供体细胞中转入基因，因此在人类细胞这种筛选重编程的阳性细胞将无法实现。本实验从未经遗传修饰的供体成体细胞分选出重编程的多潜能细胞，这就为这种技术应用到人类细胞排除障碍[9]。但由于现在获得的iPS细胞大多是通过病毒介导表达转录因子建立起来的，这样的iPS细胞基因组DNA中有随机插入的病毒DNA，存在产生肿瘤的风险，故该项技术有待进一步完善。

iPS细胞研究的应用前景主要是移植治疗和组织工程学领域。目前组织工程所用种子细胞主要为ES细胞或间充质干细胞，但是ES细胞存在免疫排斥问题，而间充质干细胞分化能力有限，iPS细胞可以由患者成体细胞诱导生成，且分化能力类似于ES细胞，因此其可为细胞、组织或器官的移植治疗实验提供大量的材料。本实验建立的小鼠iPS细胞可以作为一种实验材料来制作各种疾病模型，并可进一步对其发病机理作深入研究，为进行各类药物筛选奠定基础。

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