RP-HPLC法同时测定人血清和脑脊液中苯巴比妥、苯妥英钠和卡马西平浓度

2024年1月8日发(作者：)

RP-HPLC法同时测定人血清和脑脊液中苯巴比妥、苯妥英钠和卡马西平浓度

许贤瑞;董通;张庆;杨小英;党宏万

【摘 要】目的 建立RP-HPLC法同时测定人血清和脑脊液中苯巴比妥(PB)、苯妥英钠(PHT)和卡马西平(CBZ)浓度的方法.方法 色谱柱:AgilentZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-乙腈-水(27.5:27.5:45);流速:1.0mL·min-1;检测波长:210nm;柱温:40℃;进样量:10μm.结果 血清中PB、PHT、CBZ的线性范围依次为:2.64～52.75μg·mL-1、1.45～29.00μg·mL-1、1.04～20.80μg·mL-1;脑脊液中PB、PHT、CBZ的线性范围依次为:1.32～42.20μg·mL-1、0.73～23.20μg·mL-1、0.52～16.μg·mL-1;血清中PB、PHT、CBZ的平均提取回收率分别为:93.17%、96.17%、94.67%,脑脊液中PB、PHT、CBZ提取回收率接近100%;日间、日内RSD均小于4%.结论 本方法简单、快速、准确,适用于临床血及脑脊液浓度的检测.%Objective To establish RP - HPLC method for

simultaneous determination of phenobarbital (PB), phenytoin(PHT) and

carbamazepine (CBZ) in human serum and cerebrospinal fluid

(CSF).Methods Aglient ZORBAX SB -C18 (250mm ×4.6mm, 5μm) was

mobile phase was water- methanol- acetonitrile

(27.5:27.5:45).The flow rate was 1.0 mL · min- 1 and the detection

wavelength was column temperature was 40℃ and sample size

was 101μs The linear relation of PB,PT and CBZ were 2.64 ～ 52.75

μg · mL - 1, 1.45 ～ 29.00μg · mL- 1, 1.04 ～ 20.801μg · mL - 1 respectively

in human serum and 1.32 ～42.20μg · mL-1 ,0.73 ～ 23.20μ g · mL-1 ,0.52 ～ 16.64μg · mL -1 in cerebrospinal fluid average

recovery rate of PB, PHT and CBZ were 93.17％ 、96.17％ 、94.67％

respectively in human serum and nearly 100％ in cerebrospinal

RSD for the inter - day and intra - day of three drugs were less than

4％.Conclusion The method is sample, fast, accurate and suitable for

determination PB, PHT and CBZ in human serum and cerebrospinal fluid of

drug concentration.

【期刊名称】《宁夏医科大学学报》

【年(卷),期】2011(033)004

【总页数】4页(P360-363)

【关键词】苯巴比妥;苯妥英;卡马西平;脑脊液;血清;高效液相色谱法

【作 者】许贤瑞;董通;张庆;杨小英;党宏万

【作者单位】宁夏医科大学,银川,75004;宁夏医科大学,银川,75004;宁夏医科大学附属医院神经内科,银川,750004;宁夏医科大学附属医院药剂科,银川,750004;宁夏医科大学附属医院药剂科,银川,750004

【正文语种】中 文

【中图分类】R446

癫痫是常见的神经系统疾病之一。目前，癫痫患者服用抗癫痫药物(anti-epileptic

drugs，AEDs)仍然是控制癫痫发作的最重要的手段。传统AEDs治疗窗窄、个体差异大，疗效和毒性反应与血药浓度密切相关，临床医生仅凭经验给药往往达不到有效血药浓度，而通过对AEDs浓度的监测可为临床医生调整药物剂量、个体化、

规范治疗提供依据。国内外监测AEDs血药浓度的报道广泛[1-4]，但是同时检测血清和脑脊液中的药物浓度报道较少。因此，我们建立了一种快速、灵敏、实用的采用RP-HPLC同时测定血清和脑脊液中传统AEDs苯巴比妥(phenobarbital,PB)、苯妥英(phenytoin,PHT)、卡马西平(carbamazepin,CBZ)药物浓度的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪：包括四元泵、二极管阵列检测器、自动脱气机、柱温箱、自动进样、Agilent色谱工作站等；XH-B型涡旋混合器和80-2B台式离心机(姜堰市新康医疗器械公司)；HGC-12氮吹仪和HPD-25隔膜真空泵(天津恒奥科技有限公司)；1/10万 梅特勒-托利多电子分析天平；KQ-500VDY医用三频数控超声清洗机(昆山市超声仪器公司)。

1.2 试药 对照品 苯巴比妥对照品(国家麻醉品实验室，批号1219-9201)；卡马西平对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0142-9503)，苯妥英钠对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100201-200401)；甲醇、乙腈均为色谱纯；水为纯净水；乙醚为分析纯；空白血清(宁夏医科大学附属医院输血科提供)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-乙腈-水(27.5∶27.5∶45)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：210nm；柱温：40℃；进样量：10μL。

2.2 对照品溶液的配制 精密称取PB、PHT和CBZ对照品2.11、1.16和0.832mg置10mL量瓶中，以甲醇定容至刻度、摇匀，即得含PB、PHT和CBZ分别为211、116和83.2μg·mL-1的混合对照品储备液为母液Ⅰ；取母液Ⅰ2.5mL置10mL量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，即得含PB、PHT和CBZ分别为：52.75、29.00和20.80μg·mL-1的混合对照品溶液为母液Ⅱ，置于4℃冰箱密封保存备用。

2.3 血样处理 取血清100μL置5mL圆底带盖塑料管中，加入乙醚2.5mL后涡旋振摇3min,离心10min(3000r·min-1)吸取上层有机相于另一干燥管中，于50℃空气流吹干(通风橱内进行)，残渣用100μL流动相复溶，涡旋1min，离心10min

(14000 r·min-1)取上清液,10μL进样，记录色谱图，见图1。

2.4 脑脊液处理 取脑脊液100μL置1.5mL锥形离心管中，离心10min(14000

r·min-1)取上清液,10μL进样,记录色谱图，见图2。

A Bt/minA.空白血清; B.空白血清加对照品 ;;图1 血清中AEDs色谱图

A Bt/minA.空白脑脊液; B.空白脑脊液加对照品

;;图2 脑脊液中AEDs色谱图

2.5 血清标准曲线的绘制 取不同体积的母液Ⅱ置于5mL圆底带盖塑料管中，于50℃空气流吹干，分别加入空白血清100μL，精密配制成含PB为：52.75、31.65、21.10、10.55、5.28、2.64μg·mL-1；含PHT为：29.00、17.40、11.60、5.80、2.90、1.45μg·mL-1；含CBZ为：20.80、12.48、8.32、4.16、2.08、1.04μg·mL-1的血清标准系列溶液6管，按“2.3项”下方法处理后进样，PB、PHT和CBZ的保留时间分别为：4.2、5.7和6.5min。以外标法峰面积对浓度进行线性回归，结果见表1。

2.6 脑脊液标准曲线的绘制 取不同体积的母液Ⅱ置于1.5mL锥形离心管中，于50℃空气流吹干，分别加入空白脑脊液100μL，精密配制成含PB为：42.20、31.65、21.10、10.55、5.28、2.64、1.32μg·mL-1；含PHT为：23.20、17.40、11.60、5.80、2.90、1.45、0.73μg·mL-1；含CBZ为：16.64、12.48、8.32、4.16、2.08、1.04、0.52μg·mL-1的脑脊液标准系列溶液7管，按“2.4项”下方法处理进样，PB、PHT和CBZ的保留时间同血清。以外标法峰面积对浓度进行线性回归，结果见表1。

表1 血清和脑脊液PB、PHT、CBZ线性回归方程和线性范围样品AEDs线性回归方程相关系数(r)线性范围/(μg·mL-1)血清PBY=44.390X-10.1030.99982.64～52.75PHTY=59.314X-19.2100.99981.45～29.00CBZY=38.151X-9.75440.99991.04～20.80脑脊液PBY=49.539X-20.0460.99991.32～42.20PHTY=62.428X-5.75930.99990.73～23.20CBZY=41.437X-8.01030.99990.52～16.64

2.7 精密度试验 取不同体积的母液Ⅱ，置50℃空气流吹干，分别加入空白血清及脑脊液各100μL，配制成含高、中、低三种不同浓度的血清和脑脊液溶液各5份，血清按“2.3项”下方法处理进样，脑脊液按“2.4”项下处理进样，分别在同日内测定5次，连续测定3d。计算血清和脑脊液日内、日间精密度，结果见表2。

2.8 回收率试验 取不同体积的母液Ⅱ，置50℃空气流吹干，分别加入空白血清和脑脊液各100μL，配制成含高、中、低三种不同浓度的血清和脑脊液溶液各5份，血清按“2.3项”下方法处理进样，脑脊液按“2.4”项下处理进样，分别计算PB、PHT、CBZ的方法回收率(方法回收率=测定浓度/加入浓度×100%)；同时取不同体积的母液Ⅱ,置50℃空气流吹干，直接用流动相100μL复溶，制成高、中、低三种不同浓度的溶液，离心10min (14000 r·min-1)取上清液，10μL进样，测定对照峰面积，将两组峰面积进行比较，计算提取回收率，结果见表2。血清PB、PHT、CBZ日内RSD分别为：2.01%～3.55%、1.35%～4.02%、2.02%～2.83%之间，日间RSD分别为：1.92%～2.73%、2.64%～4.38%、2.40%～3.15%之间；脑脊液PB、PHT、CBZ日内RSD分别为：2.00%～3.55%、2.30%～4.06%、1.76%～3.49%之间，日间RSD分别为：2.48%～3.15%、2.85%～3.86%、2.54%～4.30%之间。

表2 精密度及回收率试验样品AEDs加入浓度/(μg·mL-1)测得浓度/(μg·mL-1)方法回收率/%峰面积样品对照品提取回收率/%RSD/%日内日间血清

PB5.285.2599.43221.98230.0496.50±2.123.552.1621.1020.9999.48922.51991.1893.10±1.062.012.7342.2042.31100.261876.222021.0892.90±1.542.531.92PHT2.902.93101.03155.84163.6595.30±2.073.763.9111.6011.61100.09686.70701.6297.90±0.934.024.3823.2023.24100.171353.211420.3095.30±1.791.352.64CBZ2.082.0397.6068.2373.4293.20±2.862.022.888.328.32100.00305.00323.2694.40±1.992.833.1516.6416.74100.60622.56646.4196.40±3.372.432.40脑脊液PB2.642.68101.51113.53114.9898.80±2.303.553.1510.5510.78102.18515.26508.89101.3±0.962.002.4831.6531.98101.041533.901516.3101.2±1.602.532.69PHT1.451.45100.0081.5481.8299.70±2.172.323.865.805.80100.00359.70350.71102.6±0.972.302.8517.4017.3599.711070.301065.2100.5±1.884.063.00CBZ1.041.05100.9636.8436.66100.6±3.053.494.304.164.21101.20168.82170.6599.00±2.842.402.9812.4812.53100.40524.10531.8098.60±0.771.762.54

3 讨论

3.1 色谱条件的优化 本实验曾用Aglient ZORBAX SB

C18(150mm×4.6mm,5μm)色谱柱，结果PHT和CBZ出峰时间重叠，无法分离，改用Aglient ZORBAX SB C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱后，使PB、PHT、CBZ各组分的出峰时间较前后延，PHT和CBZ两主峰分离完全，峰形良好。考虑盐可能使色谱柱过饱和、塌陷或柱压升高，缩短色谱柱的寿命，同时对进样器和泵损害较大，故试用文献[3]甲醇-水为流动相，发现峰形较宽，易出现拖尾，经反复摸索，加入乙腈，参考文献[1]，最终将甲醇-乙腈-水比例调整为：27.5∶27.5∶45，从而降低了流动相的黏度，柱效提高，峰形尖锐，且重现性好。本实验比较0.8ml·min-1和1.0 ml·min-1流速，发现流速为1.0 ml·min-1时，出峰较快，分离度好。同时将柱温由30℃提高到40℃时，可降低塔板高度，分析

时间缩短，7min内可完成三种AEDs浓度的同时测定，有利于临床样本的快速、准确的检测。

本实验对PB、PHT、CBZ对照品溶液进行紫外扫描，结果210nm和240nm波长3种AEDs均有较强的吸收峰，采用双通道同步检测210nm和240nm波长处的峰面积，发现210nm时3种AEDS的峰面积最大，干扰小，故检测波长定为210nm。

3.2 样品处理方法的选择 在血样的处理中，用二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙酸乙酯作提取溶剂均有报道[1,2,5]，本实验选择了毒性相对较小的乙醚和乙酸乙酯分别进行了检测，结果表明两者的提取回收率无明显差别，但乙醚具有挥发快、提取杂质少、分离度好的优点，故用乙醚为提取溶剂。国内外对脑脊液中AEDs浓度测定的报道较少，有学者用高效液相色谱法同时检测兔血浆和脑脊液中的卡马西平及其环氧化物的报道中[6]，脑脊液亦用乙醚做提取溶剂，操作步骤复杂，本实验考虑人脑脊液中主要成分为水，蛋白含量低，干扰较少，直接将脑脊液高速离心后进样，结果表明，图谱峰形、分离度均较好，无干扰峰。血浆和脑脊液样品检测线性、精密度、回收率等指标均符合生物样品分析标准。

本试验方法中，样本处理步骤简单易行、对仪器要求低，方法准确、重现性好，可用于人血清和脑脊液中3种AEDs的药物浓度监测，为临床医生及时调整用药，改善疗效，避免和减少不良反应的发生，提高疗效等提供了依据。

【相关文献】

[1] 王晓娟，袁君，陈艳，等，反相高效液相色谱法同时测定苯巴比妥、苯妥英和卡马西平的血药浓度[J].药物研究，2010，19(5)：11-12.

[2] 孙增先，周金玉，张骞峰，等，反相高效液相色谱法快速测定3 种抗癫痫药物血药浓度[J].中国

现代应用药学杂志，2004，21(4)：317-318.

[3] 赵宁，姚妍妍，郭玉梅，等.高效液相色谱法测定3种抗癫痫药物的血药浓度[J].科技信息，2009，23：446-447.

[4] Patil KM,Bodhankar aneous determination of

lamotrigine,phenobarbitone,carbama-zepine and phenytoin in human serum by high-performance liquid chromatography [J].Pharma-ceutical and Biomedical

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[5] 朱光辉，王增寿.高效液相色谱法测定苯巴比妥、苯妥英、卡马西平的血药浓度[J].中国临床药学杂志，2001，10(1)：21-23.

[6] 周红宇，邱相君，陈醒言，等.高效液相色谱法同时检测兔血浆和脑脊液中的卡马西平及其环氧化物[J].医药导报，2006，25(3)：183-185.