2024年1月12日发(作者：)
34
中国兽医杂志2020年（第56卷）第11期Chinese
Journai
of
Veterinao
MedicineAMA1蛋白
i隆抗体的制备及其
鉴定罗伏兵1
,刘晓冬J梁琳2
,刘贤勇3，徐发荣1
,沈光年1
,马志军J索勋3，汤新明2（1.北京市动物疫病预防控制中心，北京大兴102629
&
2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京海淀100193
；
3.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193）摘要:为了研究巨型艾美耳球虫顶膜抗原1(
AMA1)的细胞定位及功能，制备了抗AMA1的单克隆抗体并进行了鉴定$
首先，用大肠杆菌(DE3)表达了巨型艾美耳球虫AMA1蛋白，蛋白经纯化后免疫小鼠，测定小鼠血清中AMA1抗体滴度$然
后进行杂交瘤细胞的制备和克隆筛选,获得了
16株分泌产生AMA1抗体的杂交瘤细胞株。最后用免疫印迹和间接免疫荧
光试验对
单克隆抗体进行
$结果显示， 为21和34的杂交
生的抗体可识别巨
球虫可溶性抗原中的AMA1组分;编号为34和35的抗体与巨型艾美耳球虫子抱子反应后,荧光信号集中于子抱子的顶质体和细胞膜
部位。本试验制备的抗AMA1的单克隆抗体，为巨型艾美耳球虫生物学和免疫学研究提供了科学依据$关键词：巨
球虫；顶膜抗原1;单克隆抗体；免疫印迹；免疫荧文献标志码：A
中图分类号：R382.
3+2
文章编号：0529-6005(2020)
11—0034—03Preparation
and
Application
of
Monoclonal
Antibodies
against
Apical
Membrane
Antigen
1 of
Eimeria
maximaLU0
Fu-bing1，LIU
Xiav-dong1，LUNG
Lin2，LU
Xian-yong3，XU
Fa-ong1，
SHEN
Guang-nian1，MA
Zhi-jun1，SU0
Xun3，TANG
Xin-ming2(
gCenteoeooAnimaeDiseaseContooeand
Poeeention
，
Beiiing102629
，
China
；
uteoeAnimae
Sciences
，Chinese
Academy
of
Agriculturai
Sciences
，Beijing
100193
，China
；
3.
Colleye
of VeterinaoMedicine
，
ChinaAgoicuetuoaeUnieeosity
，
Beiiing100193
，
China)Abstracr:
To
study
the
cellular localization
and
function
of
apicai
membrane
antigen
1
(
AMA1
)
of
Eiperic
maxica，monoclonai
antibodies
ayainst
AMA1
were
prepared
and
identified.
The
mice
were
irnmunized
with
recombinant
AMA1
protein
expressed
by
E.
coli
(
DE3
).
Then，hybridoma
celt
preparation
and
clonai
screening
were
performed，and
16
hybridoma
celt
Ones
producing
AMA1
antidodies
were
obtained.
my，the
monoclonai
antibodies
were
identified
by
Western
Blot
and
indirect
iRmunoXuorescenco
assay.
The
results
showed
that
the
antibodies
produced
by
the
hybridoma
celt
Ones
numbered
21
and
34
could
recognize
the
native
AMA1
of
the
E.
maxima
soluble
antigen.
The
antidodRs
numbered 34
and
35
oacted
with
E.
maxima
sporozoites
with
the
fuorescence
signai
concentrated
in
the
apicai
and
celt
membrane
of
the
sporozoite.
The
monoclonai
antibodies
ayainst AMA1
prepared
in
this
study
laid
the
foundation
for
the
biologicai
and
immunologicai
research
of
E.
words:
Eimeria
maxima
；
AMA1
；
monoclonai
antidody
；
Western
Blot
；
indirect
iRmunoXuorescenco
assayCorresponding
author：TANG
Xin-ming，E-maii
:
tangxinming@caas.
cn鸡球虫病是艾美耳球虫感染引起的严重危害鸡业的寄生，全球年因球
造成的损失
高达30
[1]$ 为组分的球
疫苗的风险。开发
高效的基因工程球虫病疫苗是
学界研究的热点。顶膜抗原！
Apicct
membrana
antigen，
AMA）
门生
分泌的I型跨膜数十年的应用历史，
收稿日期：2020—08—10影响鸡群生产性能，
区、跨膜区和胞外区组成$
AMA1蛋白门原虫中高度保守，
表
•入侵
平高[2]，可能参与
$巨基金项目：北京市家禽产业创新团队（BAIC04-2020）作者简介：
163
.com（1978
-），男，高
兽医师，硕，主要从事动物疫病诊断及综合防治技术方面的研究，E-maii:
fubingluo
@
通讯作者：汤新明，E-mail:
tanyxinming@
caas.
cn球虫AMA1
（EmAMA1）被认为是免疫原性较好的
保护性抗原，具备开发成为亚单位疫苗的潜能[3]
$
因此，深入解析EmAMA1的生物学和免疫学功能
重要
$单克隆抗
高特异性、均一
Chinese
Journai
of
Veterinaa
Medicine性以及方便生产的特点，是病原学或血清学检测
技术、感染与免疫机制等研究的主要工具之一。
本试验旨在构建一/多株抗EmAMA1的单克隆抗
体，为EmAMA1基因功能和应用研究提供科学
依据$1材料与方法1-1试验材料 巨型艾美耳球虫北京株（中国农
业大学动物医学院保存）；SP2/0骨髓瘤细胞;次黄
瞟吟-氨甲蝶吟-胸腺嚏睫核2
（
HAT）；
HRP标记的
山羊抗小鼠
IgG；
SBA
Clonotyping
System-HRP；
BALB/c雌性小鼠（购自北京华阜康生物科技股份
有限公司）。1.2
动物免疫
利用PCR从pSDEP2AAMA1S[4]
扩增EmAMA1序列后，连接至pEt28a载体,转化至
DE3菌株进行蛋白的诱导表达。获得大肠杆菌重
组表达的EmAMA1蛋白，纯化后,按每只100
$g（加
弗氏完全佐剂）颈背部皮下多点注射免疫4只
BALB/c雌性小鼠;间隔2周后，以相同操作进行加
强免疫，剂量为每只小鼠30
$g蛋白（加弗氏不完全
佐剂），加强免疫3次。于最后1次免疫后第10天，
眼眶取血，分离血清。用间接ELISA方法检测小鼠
血清中EmAMA1的抗体效价$1.3抗体检测
以纯化的EmAMA1
（0.
1
$g/孔）
包被96孔酶标板,4
k过夜;每孔加200
$L脱脂乳
封闭液,37
k封闭2
h；每孔加入小鼠血清（不同稀
释度）或细胞培养上清，每孔100
$L，37
k孵育1
h；
加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG（
1:
20
000倍稀
释），100
$L/孔,37
k孵育1
h；加入TMB底物溶
液,100
$L/孔，避光显色5
min左右；每孔加入
2
moIL
H2S04,100
$L/孔，终止反应。用酶标仪
测定双波长（0D450
nm
,
0DaQ
nm）,记录保存数据$1-4杂交瘤细胞株的建立依据单克隆抗体的制
备步骤进行。简言之，抗体滴度符合要求的小鼠（4
号小鼠），腹腔注射50
$g蛋白，进行加强免疫。免疫
后3
d取小鼠脾脏，制备脾细胞，将脾细胞与SP2/0
细胞按比例混合，按照PEG法进行细胞融合。融合
完的细胞均匀倒入30个半固体培养基（含HAT）,
置37k、5%
CO?培养箱中进行筛选培养。每个培
养基分别挑93个克隆培养在铺满胸腺细胞的96孔
板中,3
d后，按1.
3所述方法筛检分泌特异性抗体
的阳性孑L,得到阳性杂交瘤细胞株；用“
AMA1
”
“
His标签”包板,做第2次筛选；将2次筛选出来的
阳性细胞株进行亚类鉴定，得到IgG类型阳性杂交$中国兽医杂志2020年（第56卷）第11期
351-5单克隆抗体的纯化与鉴定
选择其中的3株
阳性杂交瘤细胞按体内腹水法进行大量制备，送至
北京华大蛋白质研发中心有限公司进行蛋白质纯
化,SDS-AGE以及ELISA检测抗体纯度及亲和常
数,分装后冻存于-80
k
,备用$1-6单克隆抗体的初步应用1.6.1单克隆抗体与全虫抗原的反应性检测用
巨型艾美耳球虫全虫抗原进行SDS-PAGE电泳，通
过半干转印法将蛋白转印到PVDF膜上,封闭后，取
稀释（1：
5
000
）的腹水作为一抗进行Western
Blvi检
,
抗
与
AMA1
的
异反应性$1-6-
2单克隆抗体检测EmAMA
1在巨型艾美耳球
的表
分
将
的巨
球提取子抱子,取稀释（1：2
000）的腹水作为一抗进行
间接免疫荧光试验，分析单克隆抗体与虫体天然抗
原的结合特性与检测EmAMA1在子抱子阶段的表
与分
$2结果2.1获得分泌抗EmAMA1抗体的杂交瘤细胞株
小鼠经重组EmAMA1蛋白免疫后，产生了针对
EmAMA1的特异性抗体（见中插彩版图1）,选取4
号小鼠再次进行加强免疫。取免疫后小鼠脾细胞
和SP2/0骨髓瘤细胞融合后，经第1次阳性筛选，获
得
47
性杂交
；
第
2
次
性
选,
得到19株阳性杂交瘤细胞株。将筛选出来的19株阳
性细胞株进行亚类鉴定，得到16株IgG类型阳性杂
交$2.2单克隆抗体与巨型艾美耳球虫可溶性抗原特
异性反应
巨
球
抗原
SDS-PAGE分
,
得的
16
单克
抗
进行免疫印
试
验。结果显示,编号为21与34的单克隆抗体与全
虫抗原反应后，出现清晰的目的条带（约60
kDa）,
说明这2株单克隆抗体均能够识别巨型艾美耳球虫
中
异性的
EmAMA1
组分（
2）$2.3
EmAMA1在巨型艾美耳球虫子抱子的表达分
布为了验证获得的单克隆抗体能否识别巨型艾
美耳球虫EmAMA1抗原，进行了间接免疫荧光试
验$
结果显
,
选
得的
16
单克
抗
,
编号为34和45的单克隆抗体能够识别巨型艾美耳
球虫子抱子的AMA1,在顶质体和胞浆中检测到特
异性的荧光信号（见中插彩版图3）$结果表明，编
号为34和45的单克隆抗体与EmAMA1具有良好
反应性，为研究EmAMA1蛋白的表达分布及免疫学
性提
了
学依
$
36
中国兽医杂志2020年（第56卷）第11期Chinese
Journal
of Veterinaro
MedicinekDa2
1007002
5
9
12
19
20
22
23
25
27
32
34
38
21
44
45图2利用免疫印迹试验筛选与巨型艾美耳球虫可溶性蛋白反应的抗EmAMAI单克隆抗体Fig.
2
Selectinn
of
monoclonal
antibodins
against
EmAMAI
that
reacted
with
native
"
maximasoluble
antigens
by
Western
Blot3讨论4结论本文筛选获得了
16株抗巨型艾美耳球虫
AMA1蛋白的单克隆抗体，其中2株（编号为21和
34）能够与巨
本文
选
得了
1
抗巨 球
AMA1蛋白的单克隆抗体，可用于后续EmAMA1基因功能
球虫可溶性抗原发生特异性和免疫学的研究$参考文献：(1
]
反应；2株（编号为34和45
）能够用于检测
EmAMA1在子抱子阶段的表达与分布$初步证实
编号为34的单克隆抗体可用于后续EmAMA1基因
功能和免疫学的研究。顶复门原虫种类繁多,包括疟原虫、弓形虫、巴
Blake
D
P,
Clark
E
L,
Macdonald S
E
,
el
ak
Population,
genetic,and
antiaenic
diversity
of
the
apicomplexan
Eimeria
tenella
and
theiv
relevanco
to
vaccine
development(J].
Proc
Nati
Acad
Sci
U
S
贝斯虫、艾美耳球
球
$与疟原虫和弓形虫相比,，其原因在于(2]
A,2015,112(38)
:E5343—y
M
W,Smith
A
L,Tomley
F
M.
The
bioloaa
of
avian
Eimei-因功能的研究相对
ia
with
an
emphasis
on
their control
by
vaccination
(J
].
Adv
Para-
一是艾美耳球虫尚不能进行有效的体外培养,导致
sitol,2005
,60
：285—330.(3
]
反向遗传
平台效率极低（5）; 对Blake
D
P,
Billington
K J,
Copestake
S
L,
el
ak
Genetic
mappingidentifies
novd
highly
protective
antiaens
for
an
apicomplexan
par美耳球虫研究的一些工具或试剂，比如单克隆抗体
相对。已报道的研究中，
抗体主要集中于
球虫的
球单克隆，其[4]
asite [
J]
.PLoS
Pathov,2011,7(2)
:
X,Wang
C,Liang
L,e^
ak
Co-irnmunization
with
two
recombinant
Eimeria
tenella
lines
expressing
inimunoprotectivv
antiaens
他细胞器或虫种的单克隆抗体极少（5V）$巨
「美
耳球虫是7种鸡球虫中免疫原性强的虫种,经口免
of
E.
maxima
elicits
enhanced
protection
against
E.
maxima
in疫5个抱子化的卵囊即可产生免疫力（2）$研究表
fection
[J
].
Parasite
Vectors
,2019
(
1 )
：347.[5
]
明，巨型艾美耳球虫AMA1蛋白为其保护性抗原之
Tang
X,
Liu
X,
Suo
X.
Towards
innovative
desian
and
application一，基于EmAMA1的DNA或重组蛋白亚单位疫苗
of
recombinant
Eimeria
as
a
vaccine
vector
[
J
].
Infect
Immun,
2020,88(5)
:e00861—19.[6]
能够为鸡群提供部分抵抗巨
免疫保
球虫感染的（3,5）$
球为疫苗
表Huang
X,Zou
J,Xu
H,el
ak
Transeenic
Eimeria
tenella
expressing
enhanced yellow
fluorescent
protein
targeted
to different
cellu达EmAMA1的重组球虫同样能够提供一定的免疫
lar
compartwents
stimumted
dichotomic
Onmune
responses
in
chickens[
J].
I
Immunol,2011
,187(7)
：3595-3602.保护力（4）$
巨
球虫激发
生的免[7]
疫应答及保护性免疫的分子机理仍不清楚。本文
Zhao
N,
Ming
S,
Lu
Y, el
ak
Identification
and
application
of
epitopes
in
EtMIC1
of
Eimeria
tenella
recoonized
by
the
monoclonal
antibodies
1-V1
and
1-H2
[
J
].
Infect
Immun,
2019
,
87
(11
)：e00596
—19.制备了针对EmAMA1的单克隆抗体，为研究巨型艾球虫激发宿主产生免疫应答的机理提供了科
学依据$
Chinese
Oournal of
Veterinary
Medicine中国兽医杂志2020年（第56卷）第11期《巨型艾美耳球虫AMA1蛋白单克隆抗体的制备及其功能鉴定》图版（作者：罗伏兵，汤新明等，正文见第34：
36页）2.0
r200
400
800
1
600
3
200
6
400
12
800
25
600
51
200
102
400
空白
阴性血清稀释倍数Serum
dilution
factor图1
加强免疫后小鼠血清中EmAMAI特异性抗体水平Fig.
1
Recombinant
EmAMAI
specific
antibody
titet
in
serum
after
the
3rd
boosi
immunizatinnanti-EmAMA
1(34)DAPIM■c
UrL__Lr__DAPIanti-EmAMA
1(34)BrightOverlay■■indirect
immunofluorascent
assay
(Bar
=
5(jim)图3利用间接免疫荧光试验筛选与巨型艾美耳球虫子苞子反应的抗EmAMA1单克隆抗体(标尺=5
^m)Fig.
3
Seloctinn
of
monoclonal
antinodins
against
EmAMA1
that
raacted
with
E.
maxima
sporazoites
by
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