2024年1月23日发(作者：)

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一种通用的质粒构建方法的探索

作者：李曼

来源：《科技创新导报》2011年第11期

摘 要:PCR产物与克隆载体连接是基因克隆环节中重要的一步。文章介绍了一种简便、通用的质粒构建方法。此法是在PCR引物设计时,在目的片段5′端加上BsaI序列,然后通过BsaI酶切产生具有相同粘性末端的载体和插入片段,经过连接,获得重组质粒。

关键词:质粒构建 反向PCR BsaI 无缝连接

中图分类号:Q782 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2011)04(b)-0085-02

A Universal throughput Method of Constructing Plasmids

(Institute of Biological Sciences and Biotechnology,Donghua University,Shanghai 201620,China)

Abstract:The article describes a simple and throughput method to construct method

is to add the sequence of BsaI to 5' primer end,producing vectors and inserts with the same cohesive

terminus by BsaI digestion,and at last to get recombinant plasmids by ligation.

Key words:plasmid construction;reverse PCR;BsaI;Seamless ligation

质粒构建技术是基因工程常用的技术之一,即将一段需要克隆的外源DNA片段插入到载体DNA分子中形成重组DNA分子,然后将该重组载体转运到宿主细胞中[1,2],常规质粒的构建方法是在插入片段和载体两端分别寻找相同的酶切位点,即双酶切后可以产生相同的粘性末端[3,4]。本方法克服了这个局限性,通过利用BsaI酶切特点实现了载体与插入片段的无缝连接。本实验以载体pKH和DNA片段CP(一种蛋白质内含子的编码基因)为例介绍这种通用并且简便的质粒构建方法。

1 材料与方法

1.1 材料

以质粒pKH作为构建质粒的载体,pMCP含有编码CP的基因。质粒pKH(3516bp)和pMCP来自加拿大DalhousieUniversityPaulLiu教授实验室,含有氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因,常被用来作为分子生物学试验的载体。本实验中所选择的pKH的插入位点位于卡那霉素抗性基因中(图1)。

1.2 引物设计与合成

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图2(A)展示了BsaI酶切位点,它的识别序列与切割序列不一致,它在识别序列后的第一位碱基和互补链的第五位碱基切割。在载体的插入位点处设计一对含有BsaI酶切位点的引物,对载体进行反向PCR,引物5'端加上BsaI酶切序列和保护碱基,另外还需要补充目的片段末端的四个碱基。在本实验中,对载体pKH进行反向PCR设计的引物为pKHA和pKHB(图2中B),从5'3'依次是保护碱基(ATC),BsaI酶切序列(阴影部分),插入片段CP端的四个碱基(小写部分),以及与载体互补序列(划线部分)。对插入片段扩增的一对引物包括保护碱基,BsaI酶切序列以及与插入片段互补的序列。如图2(C)所示,本实验用于PCR扩增CP的引物CPb1和CPb2包括了保护碱基(ATC),BsaI酶切序列(阴影部分),插入片段互补序列(划线部分)。

1.3 环形载体质粒和插入片段制备

对回收的反向PCR产物磷酸化后自连,转化感受态细胞,涂含有100?μg/mlAmp的LB平板,37℃培养12h,挑取单克隆,在含有100μg/mlAmp的液体LB培养基中培养,150r/min,37℃培养12h,提取质粒pKH'。BsaI酶切验证环形载体pKH'的正确性,并对酶切正确的质粒测序。

BsaI酶切环形载体便可获得用于质粒构建的线性载体。对PCR扩增的CP片段也利用BsaI酶切,获得插入片段。

1.4 获得重组质粒

所获得的载体与插入片段具有相同的粘性末端,用T4DNA连接酶连接即可获得重组质粒。

2 结果

2.1 环形载体获得

通过含有BsaI引物反向PCR质粒pKH,然后磷酸化,自连,转化感受态细胞获得环形载体,利用BsaI酶切可初步验证其正确。如图3所示,泳道1为阳性对照(3516bp)环形载体pKH'由于含有了BsaI酶切位点,经过BsaI酶切、电泳,呈现线性DNA的条带(泳道3和4,3520bp),而原始pKH不含有BsaI,表现为质粒条带(泳道2和5)。

2.2 酶切环形载体和插入片段

对获得的环形载体和扩增的CP均用BsaI酶切,可获得含有相同粘性末端的载体和插入片段(图4阴影部分为酶切后获得片段)。

两者连接便可获得重组质粒,这样利用了BsaI酶切的特点,使插入片段和载体达到了无缝连接的目的。

3 讨论