一种高效快速鉴定酵母转化子的酵母菌落PCR方法

2024年1月23日发(作者：)

・研究报告・BIOTECHNOLOGY BULLETIN生物技术通报2013年第12期一种高效快速鉴定酵母转化子的酵母菌落PCR方法武可婧 吕一鸣 李晶博 肖文娟 龚映雪 刘泽寰 林蒋海（暨南大学生命科学技术学院，广州 510632）摘 要： 酵母是一种重要的基因工程宿主菌，但是由于其细胞壁结构复杂牢固，普通的菌落PCR方法的成功率较低。为解决此问题，提供一种快速、简单、高效的酵母菌落PCR方法。该方法先利用溶壁酶溶解酵母细胞壁，然后利用热涨裂解细胞并进行PCR反应。此方法将酵母细胞裂解和PCR在同一个PCR管中完成。试验结果显示此方法能成功扩增目的基因且成功率高。将此方法应用于外源性内切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）的酿酒酵母转化子筛选，经与基因组PCR比较，菌落PCR与基因组PCR结果一致。结果证明此方法具有良好的稳定性，适用于酿酒酵母转化子的快速筛选。关键词： 酿酒酵母 菌落PCR 转化子 阳性克隆A Rapid and Efficient Yeast Colony PCR Method to Identify Positive

TransformantsWu Kejing Lü Yiming Li Jingbo Xiao Wenjuan Gong Yingxue Liu Zehuan Lin Jianghai（School of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou

510632）Abstract:

Yeast is an important host microorganism in genetic engineering and molecular cloning. However, because of the complex

structure of their cell wall, ordinary colony PCR method has a low success rate. To address this problem, a fast, simple and efficient yeast colony

PCR method was provided. In the novel method, a commercial available cell wall degradation enzyme, lyticase, was used to disrupt yeast cell

wall and the resulted protoblast was then bursted by heating. Into the lysis mixture, other PCR components were added and PCR reactions

were performed. In the current constructed method, the yeast cell lysis and PCR reaction were performed in one single PCR tube, which is

convenient and easy to implement. The success rate of the novel method was relatively high compared to traditional ones. Using this method, the

Saccharomyces cerevisiae transformants of exogenous endoglucanase（EG）were screened. Compared to PCR using genomic DNA, the results

of colony PCR were consistent with those from genomic PCR. The results indicated that the novel method was of good stability, repeatability and

suitable for the rapid screening of the S. cerevisiae words:

Saccharomyces cerevisiae Colony PCR Transformant Positive clone酿酒酵母是最简单的真核生物，同时又具有类似原核生物的生长特性，便于培养和进行遗传操作的优点，是一种模式真核生物和模式实验系统，被［1］称为真核生物的“大肠杆菌”。它与人类的关系行菌落PCR等一系列方法来鉴定酵母转化后的阳性克隆。但是提取酵母基因组耗时较长，不利于大批量的对转化子进行鉴定。而特异性底物筛选同样是费时，且一些底物的价钱也很昂贵。因此，通常还是选择菌落PCR的方法鉴定酵母转化后的阳性克隆。酵母细胞的细胞壁主要成分为多糖（85%-90%）和蛋白质（10%-15%），其中多糖是由甘露聚糖、β-葡聚糖和少量的几丁质等组成，处于细胞壁内层的β-葡聚糖与几丁质共价相连，起到细胞骨架的作极为密切，是人类实践中应用较早的一类微生物［2］，同时它也被广泛用作基因克隆和表达的宿主菌。为了鉴定克隆到酵母细胞内的外源基因，可以通过提取酵母基因组后通过PCR扩增目的基因、与特异性底物形成水解圈、荧光基团、挑取单克隆进收稿日期： 2013-06-30基金项目：广东省科技计划（2012B020311005）作者简介：武可婧，女，硕士研究生，研究方向：微生物功能蛋白；E-mail：@通讯作者：林蒋海，博士，副研究员，研究方向：基因工程，代谢工程；E-mail：@

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Biotechnology Bulletin2013年第12期用；而外层的甘露聚糖与中层蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸以O-糖苷键相连接，形成的甘露糖蛋白覆。酵母盖于细胞表面，给予酵母细胞一定的韧性［3］细胞壁独特的结构致使其难以被普通高温煮沸法打破，因此普通细菌菌落PCR的方法直接应用于酵。为提高酵母菌落PCR母，成功率往往比较低［1，3］的成功率，在PCR反应前，需要对酵母进行破壁处理，但是通常的破壁方法，如研磨法、冻融法、高压均质法、超声波法等，对酵母细胞的破壁效果不。为解决此问题，本研究利用商品化的溶壁理想［4］酶，通过重新设计破壁反应时间和反应程序，提出一种新的简单高效的酵母菌落PCR方法，并将该方法运用于整合克隆到酵母基因组的内切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）转化子筛选，从而大大缩短酵母转化后阳性克隆鉴定的时间，提高试验效率。温浴10 min。然后向各PCR管内加入其余PCR反应成分（含Taq酶1.5 U，dNTP各2.5 mmol/L，1×buffer，上下游引物各10 pmol/μL），使PCR反应终体积为50 μL，进行45个循环PCR扩增。本研究以酿酒酵母肌动蛋白基因ACT1为扩增目的基因，扩增引物分别为：ACT1F：5'-GTTTAGAGGTTGCTGCTTTGGTT-3'和ACT1R：5'-GATAGAACCACCAATCCAGAC-3'；扩增产物为1 031 bp。PCR引物由中美泰和生物技术（北京）有限公司和英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。1.2.2 菌落PCR鉴定内切葡聚糖酶（endoglucanase，，将来源于EG）转化子 利用δ整合的方法［5］Trichoderma reesei（里氏木霉）的内切葡聚糖酶基因（EGI，GenBank 登录号M15665.1）整合到酿酒酵母W303-1a的基因组中。转化产物于YPD固体平板培养基30℃培养2 d。待菌落形成后，随机选取10个克隆进行菌落PCR鉴定。同时分别提取此10个克隆的基因组，用基因组PCR方法进行鉴定。以ACT1基因作为对照基因。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种 本研究所用的酿酒酵母菌株为W303-1a，由江南大学生物工程学院的张梁馈赠。1.1.2 培养基 YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；固体培养基添加1.5％琼脂粉，高压灭菌20 min。1.1.3 仪器和试剂 电击转化仪（Bio-Rad Gene

Pulser Xcell），PCR仪（东胜EDC-810），电泳仪（北京六一DYY-8C），凝胶成像系统（北京创美伟业公司），微型离心机（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司LX-100）。溶壁酶（天根生化科技（北京）有限公司），PCR反应用Taq酶，dNTPs，10×PCR

buffer均购于广州威佳科技有限公司。2 结果2.1 细胞数对菌落PCR的影响不同细胞数的菌落PCR结果如图1所示。培养3 d的酵母，当细胞数为1×103、2.5×103、5×103、1×104个，利用上述破壁方法均能较好地释放出基因组，且均能特异地扩增出目的基因片段；而当细胞数为2.5×104，5×104个时，没有扩增出目的条带。而培养1.5 d的酵母菌当细胞数超过5×103个时，PCR反应开始受到抑制，不能扩增出目的条带。该结果表明，酵母细胞数会影响菌落PCR的成功率。培养时间不一的酵母细胞对PCR结果影响不一样，这可能是溶壁酶对不同生长状态的酵母细胞的细胞壁活性不同；对对数生长期细胞的活性高，而对稳定期细胞的活性低。因此对于1.5 d的细胞，5×103个细胞就能裂解出相当于1×104个稳定期细胞的细胞壁，从而对PCR反应产生相似程度的抑制效应。1.2 方法1.2.1 菌落PCR方法 将W303-1a菌种于YPD液体培养基中30℃，200 r/min摇床培养，分别于1.5

d和3 d时吸取菌液，根据其OD600估算细胞数。将菌液于12 000 r/min离心1 min，收集菌体。用0.06

mol/L，pH7.4的磷酸缓冲液将菌体重悬稀释至不同2.5×103，浓度，使5 μL重悬液中分别含有约1×103，5×103，1×104，2.5×104，5×104个细胞。取5 μL上述菌液于PCR管中，并加入8 U溶壁酶，置于PCR仪上30℃温浴30 min，紧接着于95℃2.2 加热破细胞的顺序对菌落PCR的影响从图2可以看出，溶壁酶破壁后即加入PCR反应成分的方法，不同培养时间，不同细胞数均没有

2013年第12期武可婧等：一种高效快速鉴定酵母转化子的酵母菌落PCR方法139示。从图3可以看出，参照基因（ACT1）及目的基因（EGI）均能被特异的扩增出来。比较菌落PCR与基因组PCR的结果，两结果一致，说明该方法具有良好的稳定性，可以用于酵母转化后阳性克隆的鉴定。M：DNA Marker DS2000；1-6：细胞数分别为1×103，2.5×103，5×103，1×104，2.5×104，5×104；P：阳性对照（W303-1a基因组DNA）；C：空白对照图1 酵 母菌分别培养3 d（A）和1.5 d（B）细胞数对菌落PCR的影响获得相应的目的基因片段，说明这种方法可能不能使酵母细胞破裂。其原因不明确，一种可能的解释是溶壁酶是一种混合酶，具有一定的蛋白酶活性。在加入PCR反应体系以后将PCR反应和细胞的破裂同时进行，裂解酶很可能会降解DNA聚合酶，从而抑制了PCR反应，而如果30℃处理后马上升温至95℃，不仅可以使酵母细胞充分破裂，也可以使裂解酶失活从而避免影响后续的PCR反应。A，B：菌落PCR；C，D：基因组PCR；A，C：扩增ACT1基因；B，D：扩增EGI基因；M：DNA Marker DS2000；1-9：9个酵母转化子；P：阳性对照（A和C中以W303-1a基因组DNA为模板，B和D中以含有EGI基因的质粒为模板）；C：空白对照图3

EGI转化子菌落PCR与基因组PCR的结果3 讨论菌落PCR是鉴定外源基因克隆的最方便快捷酵母菌分别培养3 d（A）和1.5 d（B）；M：DNA Marker DS2000；1-6：细胞数分别为1×10，2.5×10，5×10，1×10，2.5×10，5×10；P：阳性对照（W303-1a基因组DNA）；C：空白对照333444的方法，但由于酵母细胞壁的特殊结构及成分，通常的酵母菌落PCR成功率不高。本研究利用商业化的酵母细胞壁裂解酶改进传统菌落PCR的方法，相对于传统的酵母菌落PCR的方法最大优势在于简便高效，稳定性好。该方法将酵母细胞破壁，裂解和PCR反应集中在一个PCR管中进行，用溶壁酶30℃温浴30 min，95℃，10 min后即可做后续的PCR反应，与彭苗苗［6］等报道的利用溶壁酶30℃水浴20 min，-80℃，5 min后无菌水稀释作模板的方法相图2 破细胞的顺序对菌落PCR的影响2.3 菌落PCR与基因组PCR的结果比较随机挑选10个转化有EGI基因的单菌落进行细胞裂解，裂解产物分两份，分别用EGI和ACT1基因的引物进行菌落PCR，同时将所挑的克隆经YPD扩大培养后提取基因组后进行PCR。结果如图3所

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Biotechnology Bulletin2013年第12期比更省时省力。且本研究的方法不需要机械破壁法的辅助，反应条件温和。也有报道［7］用100℃热处理后再用乙醇沉淀、浓缩的方法来鉴定重组酵母克隆，但操作较繁琐，且高温煮沸可能会引起基因组模板的降解，煮沸过程中也容易引起污染。本研究所采用的用溶壁酶30℃处理30 min，95℃，10 min的破壁方法，能够得到很好的破壁效果。与之前阳辛凤等［1］报道的溶壁酶的破壁效果微弱形成了对比。王志博等［8］曾报道用蜗牛酶和溶菌酶的混合酶液对酵母细胞进行破壁，所得结果是酶量300 mg（10 mg/mL），pH5.0，反应温度45℃，反应时间6 h破壁效果最佳，该方法与本文的方法相比所需酶量大且耗时。通过对内切葡聚糖酶转化子的菌落PCR及基因组PCR的对照试验，证明了该方法的有效性和稳定性。同时本研究的结果表明，酵母细胞数对菌落PCR具有重要的影响，因此控制细胞数是菌落PCR成功的一个关键因素。该方法不仅操作方便，而且重复性也很好。在实验室操作中，可以用此方法进行酵母细胞转化后阳性克隆的鉴定。方法用于EGI的酿酒酵母转化子的鉴定，参照基因（ACT1）及目的基因（EGI）均能被特异扩增。参 考 文 献［1］ 阳 辛凤, 高秋芳, 李锡敏, 等. 菌落PCR快速扩增工业酿酒酵母基因组DNA片段［J］. 生物技术通报, 2010（9）：215-219.［2］ 于 景芝. 酵母生产与应用手册［M］. 北京：中国轻工业出版社,

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Res, 1989, 17（10）：4000.［4］ 刘 晓永, 王强, 胡永金.用微珠涡流法破壁酵母细胞［J］. 吉首大学学报, 2006, 27（6）：110-113.［5］ Y amada R, Taniguchi N, Tanaka T, et al. Cocktail δ-integration：a

novel method to construct cellulolytic enzyme expression ratio-optimi-zed yeast strains［J］. Microbial Cell Factories, 2010（9）：32-39.［6］ 彭 苗苗, 李晓玲, 张德春.毕赤酵母转化子表型的菌落PCR鉴定方法研究［J］.江苏农业科学, 2011, 39（3）：63-64.［7］ 蔡 欣, 段聚宝, 邹民吉, 等.一种快速鉴定重组酵母克隆的方法［J］.军事医学科学院院刊, 2000, 24（2）：151-152.［8］ 王 志博, 潘军, 张永根, 等. 用酶法对啤酒酵母细胞破壁优化条件的研究［J］.东北农业大学学报, 2008, 39（3）：76-79.4 结论溶壁酶处理后的酵母细胞，再经95℃处理，基因组可充分释放。将细胞数控制在5×104个，利用此方法可以得到较稳定的菌落PCR结果。将该（责任编辑 李楠）