2024年3月20日发(作者：)

PCR定量技术--PCR ELISA

来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-10-18

PCR自诞生以来，人们就在努力探索PCR定量的方法。荧光素染色凝胶电泳在PCR最初的一

段时间是唯一的检测技术，因此人们在凝胶电泳的基础上使用扫描照片进行光密度分析，以求实现PCR

的相对定量。

但是由于普通凝胶电泳检测本身的不特异性，只能进行粗略的相对定量，难以满足人们日益对精确

定量的渴望，不过由于普通凝胶电泳光密度分析简捷易行，成本低，目前还是科研还很常用。但是难以

满足临床应用的要求。

由于固相捕获技术的成熟和应用，特别是酶联免疫吸附试验（ELISA）的成功，给核酸定量提供了一

个思路。此后，应用固相捕获的PCR定量技术应运而生。即在PCR扩增以后，在微也板上借用酶联免疫

吸附试验（ELISA）的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量。被称为PCR－ELISA：

PCR－ELISA原理：

首先，使用亲和素包被微孔板，再用生物素标记捕获探针3`端（捕获探针5`端和待检靶序列5`端的

一段互补）通过生物素和亲和素的交联作用将捕获探针固定在微孔上，制成固相捕获系统。

其次，在扩增时，引物用抗原（生物素、地高辛、荧光素酶等）标记，这样扩增产物中就会代有抗

原。

用扩增产物与微孔上的捕获探针杂交，靶序列被捕获。再在微孔中加入用辣根过氧化物酶标记的抗

体，抗体与靶序列上的抗原结合，再加入底物使之显色。从而实现定量。

虽然PCR经过长时间的探索，PCR－ELISA逐渐成熟，并有了不同的改进版本，但总的还是没有脱离

固相分离、酶标抗体的经典范畴。

PCR－ELISA的步骤：

1.核酸提取和制备

2.进行PCR扩增

3.微孔预杂交

4.产物杂交

5.显色

6.检测分析

PCR－ELISA的优点：

PCR－ELISA相对于凝胶光密度定量，无论是灵敏度、特异性、准确度上都是很大的提高，能满足临

床要求。它为PCR提供了第一个严格意义上的定量方法。并且对仪器要求较低。只要有扩增仪和酶标仪

就可以进行。

PCR－ELISA的不足及消减措施：

1.污染问题严重。PCR－ELISA在扩增之后又要进行ELISA反应，而ELISA是一个开放性的反应，特

别是洗板，很容易产生污染引起假阳性。为减小污染，一定要严格分区隔离，以避免污染。同时，使用

dUTP与UNG酶也可以在一定程度上减小污染的影响。由于PCR产物都是高浓度的。一般情况下，产物都

被扩增至2的20方以上，即使避免了扩增前的污染，但同批样本产物之间的交叉污染可能远远大于ELISA，

不能忽视。

2.显色定量分析相对于最近的探针荧光分析，无论是灵敏度还是特异性上都有差距。

3.操作繁琐，这也是严重制约临床应用的重要因素。

注意：PCR－ELISA一定要严格分区，及时进行空间和仪器消毒，严防污染。

Pcr-elisa在食品行业的应用

1、概述

PCR—ELISA技术是利用了PCR技术的高敏感性和特异性、探针的特异性、酶标仪直接读

取结果的客观性等优点创建的一项。它主要由三部分组成，第一部分是聚合酶链式反应

(PCR)，第二部分是扩增产物与探针的杂交，第三部分即常规的ELISA的抗原抗体反应和酶

标显色。该技术的关键之处是如何将这三步偶联越来。PCR—ELISA技术在不同的发展阶段

有不同的连接方式和方法。

（1）、双引物标记法

在PCR的一对引物中，其中一条引物用生物素标记，另一条引物用地高辛标记。在酶标板

上是生物素的亲和素包被(生物素的亲和素可以与生物素特异的结合)。PCR扩增后，先去除

扩增产物中的引物、dNTP、引物二聚体等小分子物质，再加入微孔板，使微孔板包被的生

物素亲和素与引物上的生物素结合而捕捉了PCR片段。然后在微孔板中加人酶标记的抗地

高辛抗体，该抗体将与另一引物上的地高辛结合形成生物素亲和素一生物素一PCR片段一

地高辛一抗地高辛抗体一酶的复合物。当加入酶的相应底物进行显色时，便可判断PCR扩

增的有光。该法简便、灵敏度高、避免了分析PCR产物时的电泳及染色过程。但易出现假

阴性、假阳性的结果。

（2）引物探针标记法

该方法将探针引用到PCR-ELISA技术中，使目的DNA的检测特异性增强，极大的避免了

假阳性、假阴性结果的出现。其基本步骤为：1、根据目的基因设计特异性引物和特异性探

针（探针用生物素标记，与探针杂交的对应引物用地高辛标记）；2、酶标板用生物素的亲和

素包被；3、PCR扩增后，通过一定的方法解链，与探针杂交，然后利用生物素与亲和素的

高亲和力将杂交产物与酶标板连接，形成酶标板—生物素—亲和素—探针—PCR产物—地

高辛—抗地高辛抗体—酶的复合物，最后加入酶的相应底物进行显色，判断PCR扩增的有

无。

A． 固相杂交法。固相杂交法是将探针或产物固定在酶标板或其他载体上再进行杂交。其中

最常用的是诱捕—PCR—ELISA法。它能使样品核酸纯化—PCR扩增—PCR产物杂交检

测在同一试管内完成，PCR扩增后，不需先去除扩增产物中的引物、dNTP、引物二聚

体等小分子物质，待杂交以后再与杂交时带进的杂质一起洗脱掉，这样既简化了样品核

酸纯化步骤，也降低了核酸纯化难度，并提高了检测速度和灵敏度。

B． 液相杂交法。液相杂交法首先是将PCR产物与探针在液相环境中进行杂交，然后再将

杂交产物固定在固相载体上检测。

2、应用

（1） 单增李斯特菌PCR-ELISA 快速检测技术研究

曹纬、王宁等人根据GenBank数据库资料, 应用分子生物学软件 DNAMAN 6 .0 和Primer

Premier 5 .0, 以单增李斯特菌的致病基因 hlyA 为基础,选用 PCR 引物, 应用地高辛标记试

剂盒,获得单增李斯特菌特异的地高辛标记片段。根据PCR 目的片段序列, 设计特异性捕获

探针,建立了单增李斯特菌 PCR-ELISA 快速检测方法。应用该方法对不同血清型的单增李

斯特菌食品分离株进行了检测, 并将 PCR 方法与 PCR -ELISA 方法对人工污染单增李斯

特菌的牛奶样品的检测敏感性进行了比较。结果表明应用单增李斯特菌特异的 PCR -ELISA

方法完成检测约需6h。该方法对单增李斯特菌分离株检测的结果, 与国家食源性疾病检测网

的鉴定结果 100%符合。经过 12h的增菌培养, PCR -ELISA 方法最低可从 25ml 样品中检

出 1CFU, 检测敏感性为传统 PCR 方法的 10~ 100 倍。

（2）转基因食品检测的应用

刘光明等人建立并优化了转基因大豆与玉米的DNA提取方法,针对CaMV35S启动子和

T-NOS终止子的序列特点设计特异性引物与探针,应用PCR-ELISA检测技术,建立了转基因

大豆与玉米中常用外源基因的快速检测体系,并应用于进出境产品的转基因检测实际工作中.

结果表明,建立的PCR-ELISA法具有操作简便、灵敏特异、结果准确的优点,可对转基因大

豆、玉米及其它转基因产品进行定性和定量检测. 同时，实验还用液相杂交与固相杂交两种

方法进行检测样品，结果显示这两种方法检测结果基本一致，两种方法均适用于实验样品的

检测。

陈茹等人用地高辛标记的PCR-ELISA技术快速检测转基因鱼，实验取含有小鼠重金属螯合

蛋白(mMT)基因启动子及人生长激素(hGH)基因的鱼样品,以Qiagene核酸纯化技术对鱼组织

DNA进行纯化.常规PCR检测显示,mMT启动基因和hGH基因的PCR产物分别为240 bp和

130bp,与设计相符.PCR产物的核酸测序结果证实其扩增产物具特异性.地高辛-PCR(Dig-PCR)

标记反应显示,2个基因均产生1条Dig标记的特异产物带.Dig-PCR-ELISA检测敏感性试验

显示,对mMT启动子和hGH基因的检测敏感性可达10

-3

,与常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳检

测方法相比,检测敏感性可提高至100～1 000倍.试验证明,针对mMT和hGH基因所建立的

Dig-PCR-ELISA技术特异可靠.