放射性小鼠肺纤维化基因表达谱生物信息学动态分析

2024年3月29日发(作者：)

放射性小鼠肺纤维化基因表达谱生物信息学动态分析

邹观莲; 陈娟; 王艳阳; 赵仁

【期刊名称】《《宁夏医科大学学报》》

【年(卷),期】2019(041)006

【总页数】7页(P577-583)

【关键词】放射性肺纤维化; 基因芯片; 生物信息学分析; 差异表达基因; 时间点

【作 者】邹观莲; 陈娟; 王艳阳; 赵仁

【作者单位】宁夏医科大学研究生院 银川750004; 宁夏医科大学总医院呼吸与危

重症医学科 银川750004; 宁夏医科大学总医院肿瘤医院放疗科 银川750004

【正文语种】中 文

【中图分类】R730.55

放射治疗是肺癌、食管癌、乳腺癌、淋巴瘤等胸部肿瘤最重要的治疗方式之一。放

射性肺纤维化（RILF）是胸部放疗引起的放射性损害，会影响放疗的有效实施、导

致胸部放疗疗效下降[1]。虽然学者们已对RILF进行了深入的研究，其具体分子机

制尚不完全清楚[2-3]。芯片技术与生物信息学分析相结合，为探索RILF进展涉及

的差异表达基因和相关通路提供了强有力的工具[4-5]。同时，我们从公共数据库

中下载RILF的基因表达数据，如 GEO[6]和 Array Express Archive 数据库[7]，

并使用更多的生物信息学方法对这些数据进行综合分析。但是，大多数可用的芯片

数据都是在一个时间点测定的。事实上，RILF的基因表达谱是随着时间的推移而

变化的，不同病程的RILF表现出不同的基因表达谱[8]。因此，有必要对RILF形

成过程中不同时间点基因表达谱的特征进行深入探索。为了了解RILF形成过程中

不同时间点基因表达谱的特征，本研究对包含小鼠RILF基因时间序列表达谱的

GDS4822数据集进行了生物信息学分析[9]。

1 材料与方法

1.1 数据收集

GDS4822[9]基因表达谱数据集来源于美国国家生物技术信息中心（NCBI）GEO

数据库（/geo/）。 对 10 周 龄 雌 性C57Bl/Ncr

小鼠，使用X-RAD 320型X射线照射仪进行胸部照射，剂量率为2.61Gy·min-1。

设置照射后 2、4、8、16、30 周 5 个检测时间点，每个时间点分别行0、5、

17.5 Gy剂量照射。每个组设置3个重复，共可以获取45个肺组织样本。对每个

肺组织样本提取RNA，采用Affymetrix Mouse 430_2芯片分析。本研究主要分

析放射性肺纤维化形成过程中的基因变化特点，所以仅分析0和17.5 Gy照射组

的芯片数据[9]。

1.2 数据处理

利用GEO2R（/geo/geo2r/）分析筛选不同时间

点RILF与对照组间的差异表达基因。P值采用Benjamini-Hochberg方法进行矫

正[10]，logFC表示RILF的差异基因相对于对照组的差值倍数。以P<0.01和

|logFC|>0.5做为差异基因的筛选标准[11]。

1.3 KEGG通路分析

KEGG为一个整合了基因组、化学及系统功能信息的数据库，将从完整测序的基因

组中得到的基因与细胞、物种与生态系统水平的系统功能关联起来。在注释、可视

化和整合发现（DAVID）数据库中[12]，通过KEGG基因通路富集分析探讨已鉴

定的差异表达基因DEGs在RILF发生和进展中的意义。以P<0.05为差异有统计

学意义。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建

STRING数据库是检索基因/蛋白质相互作用的搜索工具[13]，用于获取和预测蛋

白互作网络数据。为了构建由上调或下调DEGs编码的每个蛋白序列的互作网络，

将DEGs序列导入STRING数据库中，以综合评分>0.4为标准。使用cytoscape

软件研究这些基因之间的相互作用，揭示调控网络中的枢纽节点[14]。以节点自由

度≥10作为筛选关键基因的标准[15]。

2 结果

2.1 DEGs的筛选

照射后 2、4、8、16 和 30 周共 279、396、870、161、54 DEGs上调，223、

343、507、204、338 DEGs在不同时间点下调。见图1。

2.2 DEG的功能富集分析

为了进一步了解DEGs的功能，我们还进行了 KEGG 通路富集分析（表 1、表

2）。在 2、4、8、16及30周，发现上调的DEGs主要在泛素介导的蛋白质水解、

造血通路、昼夜节律、细胞因子受体相互作用等通路显著富集。在下调的DEGs

中，不同时间点富集的通路主要为cGMP-PKG信号通路、细胞外基质受体相互作

用、唾液分泌和肿瘤等相关通路。

图1 不同时间点差异表达基因的火山图

表1 RILF表达上调基因的KEGG通路富集分析信号通路 基因数目筛选到基因占背

景基因的百分比/%P值 基因名称2周mmu04120：Ubiquitin mediated

proteolysis 9 2.37 0.000855 UBE2D2A、XIAP、UBE3A、BIRC6、CDC20、

ITCH、UBE2C、UBE2B、TRIP12 mmu05203：Viral carcinogenesis 11 2.89

0.0015 YWHAZ、IL6ST、CCND2、UBE3A、BAX、IRF7、CDC20、H2T24、

EIF2AK2、CCNA2、ATF2 mmu05140：Leishmaniasis 6 1.58 0.0020

MAP3K7、PTPN6、IL1B、STAT1、ITGAM、H2-DMB2 mmu05164：

Influenza A 9 2.37 0.0027 TNFSF10、IRF7、IL1B、RSAD2、STAT1、EIF2AK2、

H2-DMB2、ATF2、CXCL10 mmu05162：Measles 8 2.11 0.0030 MAP3K7、

TNFSF10、SH2D1A、CCND2、IRF7、IL1B、STAT1、EIF2AK2 4周

mmu04640：Hematopoietic cell lineage 1 2.43 0.000016 IL1R2、GP5、

GP1BB、CD33、IL1B、CSF3R、GP1BA、ITGAM、CD14、ITGA2B、GP9

mmu04060：Cytokine-cytokine receptor interaction 17 3.76 0.000114

IL1R2、CCL2、CSF2RB2、CCR1、CCL8、EDA2R、TNFSF14、CXCR2、PF4、

CCL7、PPBP、CCR2、IL1RAP、IL1B、CSF3R、CSF2RB、IL22RA2

续表信号通路 基因数目筛选到基因占背景基因的百分比/%P值 基因名称

mmu05133：Pertussis 9 1.99 0.000231 IRAK4、C1QA、FOS、C1QB、

GNAI3、IL1B、C1QC、ITGAM、CD14 mmu04062：Chemokine signaling

pathway 14 3.09 0.000437 CXCL1、GNAI3、CCL2、PPBP、NCF1、CCR1、

CCR2、CXCL2、CCL9、CCL8、PF4、CXCR2、CCL7、CCL6 mmu05020：

Prion diseases 6 1.32 0.000657 C1QA、C1QB、BAX、IL1B、STIP1、C1QC 8

周mmu04640：Hematopoietic cell lineage 22 2.39 1.66×10-11IL1R2、

IL4RA、ITGA4、ITGB3、KITL、CD24A、ITGAM、GP9、GP5、CD37、CD44、

TFRC、ITGA5、GP1BB、CD33、IL1B、CSF3R、CD22、GP1BA、CSF2RA、

CD14、ITGA2B mmu04380：Osteoclast differentiation 25 2.72 2.73×10-

10FOSL2、NCF2、NCF1、SOCS3、NCF4、TGFBR2、PIK3CD、SPI1、FCGR4、

ITGB3、SIRPA、TGFB1、FCGR3、PIRB、SIRPB1A、FOS、CYBB、MAPK14、

IL1B、IKBKB、TRAF6、AKT3、SYK、TYROBP、LCP2 mmu05140：

Leishmaniasis 17 1.85 4.58×10-9 PTPN6、PTGS2、NCF2、NCF1、NCF4、

FCGR4、ITGB2、ITGA4、ITGAM、TGFB1、FCGR3、IRAK4、FOS、ITGB2L、

MAPK14、IL1B、TRAF6 mmu04670：Leukocyte transendothelial migration

20 2.18 5.14×10-7 ITGAL、NCF2、NCF1、NCF4、MMP9、PIK3CD、ACTN1、

ITGB2、ITGA4、CXCL12、ITGAM、CDH5、PRKCB、ITGB2L、RASSF5、

CYBB、RAC2、PTK2B、MAPK14、JAM2 mmu04010：MAPK signaling

pathway 29 3.16 1.95×10-6 IL1R2、FGFR3、MAP4K2、MKNK1、HSPA1A、

HSPA1B、TGFB1、FOS、RAC2、RASGRP4、MAP3K8、RASGRP2、IL1B、

TRAF6、AKT3、TRP53、TGFBR2、FLNB、PRKCB、RPS6KA3、CRKL、ARRB2、

MAPK14、NTRK2、MAPK8IP3、HSPB1、IKBKB、CACNA1D、CD14 16周

mmu04710：Circadian rhythm mmu04060：Cytokine-cytokine receptor

interaction mmu04640：Hematopoietic cell lineage mmu05020：Prion

diseases mmu04390：Hippo signaling pathway mmu04060：Cytokine-

cytokine receptor interaction mmu04640：Hematopoietic cell lineage

mmu05020：Prion diseases mmu04390：Hippo signaling pathway 30周

mmu04060：Cytokine-cytokine receptor interaction 5 2.48 0.000101

NR1D1、PER2、PER3、BHLHE40、BHLHE41 9 4.46 0.000705 CCL11、LIF、

TSLP、VEGFD、IL1B、CSF3R、EDA2R、CCL7、IL1A 5 2.48 0.004506

FCER2A、GP1BB、IL1B、CSF3R、IL1A 3 1.48 0.02697 EGR1、IL1B、IL1A 5

2.48 0.032699 AJUBA、BMP4、PARD6B、CCND1、ID2 4 6.10 0.031145

CXCL9、CCL8、EDA2R、IL7R 5 2.48 0.004506 FCER2A、GP1BB、IL1B、

CSF3R、IL1A 3 1.48 0.02697 EGR1、IL1B、IL1A 5 2.48 0.032699 AJUBA、

BMP4、PARD6B、CCND1、ID2 4 6.10 0.031145 CXCL9、CCL8、EDA2R、

IL7R

表2 RILF表达下调基因的KEGG通路富集分析信号通路 基因 P值 基因名称数目

率/%2周mmu04022：cGMP-PKG signaling pathway 9 2.73 0.0007 ATP2B1、

MEF2C、MAPK1、PDE5A、PDE3B、ATP1A1、CREB5、PDE3A、PRKG1

mmu04915：Estrogen signaling pathway mmu04713：Circadian

entrainment mmu04024：cAMP signaling pathway mmu04261：

Adrenergic signaling in cardiomyocytes 7 2.12 0.00084 MAPK1、FKBP5、

CREB5、HSPA1A、HSPA1B、KCNJ3、HSPA8 6 1.820.005078 MAPK1、

PER2、RYR2、PER1、PRKG1、KCNJ3 8 2.43 0.007032 ATP2B1、MAPK1、

CREBBP、PDE3B、RYR2、ATP1A1、CREB5、PDE3A 7 2.12 0.007134

ATP2B1、TNNT2、MAPK1、RYR2、ATP1A1、CREB5、MYH6 4周

mmu04512：ECM-receptor interaction 13 2.787.87×10-9COL4A4、TNC、

COL3A1、DAG1、ITGA1、SDC4、COL5A2、COL5A1、CHAD、ITGB6、

COL6A3、COL1A2、COL1A1 mmu04151：PI3K-Akt signaling pathway 21

4.493.29×10-7COL4A4、PDGFB、EFNA1、TNC、COL3A1、ITGA1、IGF1、

COL5A2、COL5A1、KDR、CHAD、IGF1R、CCND2、ITGB6、COL6A3、

COL1A2、CREB3L1、GNG2、PPP2R5E、COL1A1、ANGPT2 mmu04510：

Focal adhesion 16 3.425.67×10-7COL4A4、PDGFB、TNC、COL3A1、ITGA1、

IGF1、COL5A2、COL5A1、KDR、CHAD、IGF1R、CCND2、ITGB6、COL6A3、

COL1A2、COL1A1 mmu04974：Protein digestion and absorption 9 1.92

0.00057 COL4A4、COL3A1、COL6A3、ELN、COL1A2、COL15A1、COL1A1、

COL5A2、COL5A1 mmu05146：Amoebiasis 9 1.92 0.000423 COL4A4、

GNA14、COL3A1、COL1A2、COL1A1、PLCB1、COL5A2、COL5A1、TGFB2

8周mmu04512：ECM-receptor interaction 14 1.881.09×10-7COL4A3、

NPNT、TNC、COL3A1、VTN、SDC4、COL5A2、COL5A1、COL4A6、

COL4A5、SDC1、ITGB6、COL6A2、COL1A2 mmu04110：Cell cycle 16

2.151.71×10-7CDK1、CDC6、SKP2、CDC20、CDK7、MCM2、MCM4、

WEE1、MCM5、TGFB2、MCM6、CCNE2、CCND1、MAD2L1、CCND2、

BUB1B mmu04974：Protein digestion and absorption 13 1.758.33×10-

7COL4A3、COL14A1、COL3A1、ACE2、COL1A2、COL6A2、COL12A1、

ATP1A2、CPB1、COL5A2、COL4A6、COL5A1、COL4A5 mmu04514：Cell

adhesion molecules（CAMs）15 2.020.000245 NRCAM、H2-Q2、CLDN8、

ALCAM、VCAM1、SDC1、CADM1、CLDN1、H2-AA、NECTIN3、CDH2、

SDC4、H2-DMA、NEGR1、SDC2 mmu04151：PI3K-Akt signaling pathway

22 2.96 0.000067 COL4A3、TNC、COL3A1、LPAR4、IGF1、VTN、CREB5、

FGF13、COL5A2、COL4A6、COL5A1、BRCA1、COL4A5、CCNE2、CCND1、

CCND2、ITGB6、COL6A2、COL1A2、PDGFC、ANGPT2、PPP2R2C 16周

mmu04970：Salivary secretion mmu04713：Circadian entrainment

mmu04915：Estrogen signaling pathway mmu04921：Oxytocin signaling

pathway mmu04210：Apoptosis 30周mmu05200：Pathways in cancer 5

1.95 0.006824 CD38、ADRB2、PLCB4、ADCY8、PLCB1 5 1.95 0.015611

PLCB4、ADCY8、PLCB1、KCNJ3、RASD1 5 1.95 0.015611 PLCB4、ADCY8、

PLCB1、KCNJ3、HSPA8 6 2.34 0.019421 CD38、CDKN1A、PLCB4、ADCY8、

PLCB1、KCNJ3 4 1.56 0.021008 CSF2RB2、NFKBIA、CSF2RB、FAS 12

2.650.018675 BMP4、E2F3、ADCY7、MSH3、CXCR4、BCL2、ARAF、

RUNX1T1、RUNX1T1、PDGFRB、KIT、STK4、FN1

续表信号通路 基因 P值 基因名称数目 率/%mmu04010：MAPK signaling

pathway 9 1.99 0.021585 DUSP5、MAP4K4、CACNA2D1、DUSP16、IL1B、

PDGFRB、NR4A1、STK4、CDC25B mmu04640：Hematopoietic cell

lineage mmu04925：Aldosterone synthesis and secretion mmu05215：

Prostate cancer 5 1.10 0.027199 FCER2A、IL1B、CD22、KIT、ITGAM 5

1.100.029329 ADCY7、NR4A2、NR4A1、CREB5、CAMK1D 5 1.10 0.031557

E2F3、BCL2、ARAF、PDGFRB、CREB5

2.3 PPI网络分析与核心基因筛选

通过PPI网络，本研究在不同时间点筛选到了不同数量的关键基因，其中第8周

这个时间点筛选到的关键基因数目最多，共196个关键基因。其中，139个属于

上调表达，57个属于下调表达。随后的基因功能分析显示：第8周上调表达的关

键基因主要在免疫调节、防御反应及细胞活化过程中发挥作用。下调的关键基因主

要在细胞周期、细胞分裂及染色体分离过程中发挥作用。

图2 不同时间点基因芯片数据中筛选到的关键基因数目

3 讨论

RILF的发生是一个多步骤、多阶段的过程，发生时间较长。不同时间点RILF的基

因表达谱特征对于RILF的诊断及治疗至关重要。目前，临床上针对RILF的治疗手

段较为单一，不能随时间变化和疾病转归进行及时调整，归根结底主要是受制于对

RILF发生过程中不同基因表达和关键分子生物学事件认识的不足[16]。对RILF发

生过程中不同时间点基因表达谱的分析，有助于了解RILF的发生机制，开发有针

对性的RILF诊断标记物，并为RILF的个体化治疗提供数据支撑。

本研究使用时间序列芯片数据来分析照射后2、4、8、16及30周小鼠肺组织照

射后的基因表达谱。每个时间点的DEGs不同。然而，在照射后4周和8周发现

了更多的DEGs，意味着这些时间点在RILF进程中至关重要。KEGG通路分析中

发现泛素介导的蛋白水解、造血细胞系、细胞因子受体相互作用、cGMP-PKG信

号通路、细胞外基质受体相互作用等通路参与到RILF的发生、发展。这些结果将

一些重要生物学过程与RILF的发展之间建立了联系，为进一步的研究提供了线索。

随后的关键基因分析发现：第8周这个时间点筛选到的关键基因数目最多，共

196个关键基因。其中，139个属于上调表达，57个属于下调表达。随后的基因

功能分析显示：第8周上调表达的关键基因主要在免疫调节、防御反应及细胞活

化过程中发挥作用。下调的关键基因主要在细胞周期、细胞分裂及染色体分离过程

中发挥作用。辐射可以刺激肿瘤和非肿瘤微环境中的免疫活性。首先，辐射通过启

动淋巴细胞浸润，特别是T细胞的募集来激活炎症和免疫。在一系列纤维化疾病

模型中，IL-4和IL-13等2型T细胞因子通过激活成纤维细胞增殖和胶原生成来

增强纤维化过程，而1型T细胞因子则抑制这些过程[17]。其次，研究发现M2

巨噬细胞被在RILF形成中发挥重要作用。在受照射的肺组织中，GATA-3的表达

上调了交替活化的巨噬细胞（M2巨噬细胞），M2巨噬细胞和转化生长因子-β信

号通路的过度激活参与了RILF的形成[18]。另外，也有多项研究报道[15-16]辐射

后炎症细胞因子在体内的分泌。受辐射的细胞在体内产生的炎性细胞因子既诱导机

体的免疫反应又参与了RILF的形成[19]。所以，免疫调节在RILF形成中的重要作

用不言而喻。作为RILF形成的关键时间点，免疫调节发挥了重要作用，这也提示

这一时间点的治疗干预应围绕免疫调节展开。细胞周期在调控损伤后细胞增殖方面

具有重要的作用。细胞周期调控改变是RILF发生过程中的重要分子生物学事件

[20]。本研究在分析关键基因时也发现，在第8周这个时间点筛选到的下调关键基

因，其主要功能集中在细胞周期的调控。这也提示以后有关RILF发生机制的研究

需要重点关注细胞周期的变化，尤其在第8周这个时间点。

综上所述，放射对小鼠肺脏基因表达谱影响具有时效性，可促进对RILF发生病理

生理机制的认识。8周是RILF发病机制的关键时期，对该时期识别的DEGs和通

路进行更深入的研究，可能对未来研发有价值的RILF治疗方法具有重要意义。

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