2024年4月10日发(作者：)

引物设计原则及设计软件

引物设计是指在核酸分析实验中，设计引物（即DNA或RNA的特异性

引用序列），以便在PCR、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、DNA测序和

基因芯片等分析中特异性扩增所需要的特定DNA或RNA序列。引物的设计

质量直接影响到实验结果的准确性和可重复性。下面将介绍引物设计的原

则和常用的设计软件。

1.引物长度：引物的长度通常应为18-30个核苷酸，最好是20-25个

核苷酸。引物太短可能导致非特异扩增，太长则可能增加非特异连接的机

会。

含量：引物无法是CG含量过高或过低，过高可能导致引物的配

对不稳定，过低则可能降低引物与模板的亲和性。通常，引物的CG含量

应在40%-60%之间。

3.引物特异性：引物设计必须要满足特异性扩增的要求。为了保证引

物的特异性，可以使用引物设计软件进行比对，确保引物序列与其他基因

组序列没有或有很低的同源性。

4.引物间无衔接：引物的设计应该避免两个引物之间相互衔接，以免

产生杂交产物。一般来说，引物间的距离要足够远，避免二聚体或杂交产

物的形成。

5.引物的配对：引物设计时需考虑引物与模板的互补配对能力，以确

保引物与模板的亲和力。配对的最优条件是引物序列的3’端含有G或C

碱基，以提高引物与模板的互补性。

6.避免引物的互补配对：引物的设计中，要避免引物自身或引物间的

互补配对，以避免引物结合形成二聚体或形成杂交产物。

引物设计软件：

1. OligoAnalyzer：OligoAnalyzer是IDT公司开发的一款引物设计

软件。它可以根据提供的引物序列进行引物的理化性质分析，包括计算引

物的Tm值、检查引物的折叠结构、预测引物的互补配对、计算引物与模

板的自由能等。

2. Primer3：Primer3是一款广泛使用的引物设计软件。它可以根据

特定的引物设计要求，自动为给定的序列设计最佳的引物。Primer3支持

多个引物的同时设计，并可以根据用户的需求生成引物设计结果文件。

3. Beacon Designer：Beacon Designer是一款功能强大的引物设计

软件。它提供了多种引物设计算法，可以根据用户提供的序列信息进行引

物设计，并对引物进行理化性质和特异性分析。Beacon Designer还包括

了一系列的辅助功能，如引物二聚体分析、PCR产物长度检测等。

4. Geneious：Geneious是一款集成了引物设计功能的生物信息学软

件。它提供了丰富的序列分析和引物设计工具，可以根据用户提供的引物

设计要求，自动为给定的序列设计最佳的引物。Geneious还支持多重比

对，有助于引物设计的特异性检查。

综上所述，引物设计是分子生物学实验中至关重要的一步。合理设计

的引物可以保证实验结果的准确性和可重复性。在设计引物时，需要遵循

一系列原则，如适当的长度、合适的CG含量、特异性、无衔接、合理的

配对等。同时，引物设计软件的使用也能大大简化引物设计的过程，提高

设计效率和准确性。常用的引物设计软件包括OligoAnalyzer、Primer3、

Beacon Designer和Geneious等。