2024年4月10日发(作者：)

一、引物设计step by step

1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区

所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

2、用Primer Premier5搜索引物

①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy

目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer,

进入引物窗口。

②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击

Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物

长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，

参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，

所以可以选择 300～500bp.

③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结

果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显

示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3’不要出现连续的3

个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包

括：T

m

应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的T

m

值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构

信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表

示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，

应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个

条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考

察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo

来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.

⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，

然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文

档，里面有该引物的详细信息。

3、用Oligo验证评估引物

①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer

中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta

G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入

候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change

－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，

同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分

利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。

②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括

性信息，其中包括引物的T

m

值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会

比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’

端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应,因此此项绝对值应