2024年4月10日发(作者：)

Primer Express TaqMan引物探针设计

一、 安装软件ABI公司Primer Express v3.0

Primers and Probe Design For Real-Time PCR

二、 Primers/Probes Design Guideline

TaqMan Probe

Primer

Probe 与 Primer 的距离

愈近愈好, PCR产物大小建议在50-150 bp为最佳

G/C % 为 30-80 %

避免有重复序列的出现，尤其避免4个以上G的出现

Tm 值: 68-70℃ (Quantification assay)

65-67℃ (Allelic Discrimination assay)

Tm 值: 58-60℃

Probe 长 :

13~25 bases (TaqMan MGB probe)

13~30 bases (TaqMan probe)

Primer 长 :

20 bases (Optimal)

避免连续6个A的序列出现

3’端的前5个序列里不能超过2个C+G

5’端第一个序列不能为G

(如果选择FAM-dye在5’端第二个序列也可以为G)

选择C比G多的strand当作probe

b

避免 3’端的前4个序列含有3个或以上G

(GGG-MGB-3’ or GGAG-MGB-3’)

a

避免probe的中间区域含有2个或以上的CC di-nucleotides

a

a. 针对TaqMan MGB探针

b. 参数可选择设定

三、Primers & Probes（

Automatically Design

）

①

进入Primer Express 3.0软件

File→ New → 选择TaqMan MGB Quantification或TaqMan Quantification → OK

②

Tools →按Add DNA File，寻找序列存取位置，按下Add，将序列档案加入空白文件。亦可在

Sequence的界面中使用 Copy & Paste 复制和粘贴或直接输入序列。

* Primer Express Software 只能接受dan, txt, ab1,或abi的档案格式，请事先将欲分析的序列存成纯文

字档即可(若序列是从database download下来时,请刪除与序列无关的资料)。