引物设计的详细步骤

2024年4月10日发(作者：)

引物设计的详细步骤

一、引物设计step by step

1、在NCBI上搜索到目的基因,找到该基因的mRNA,在CDS选项中，找到编码区所在位置,在下面的origin

中,Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象.

2、用Primer Premier5搜索引物

①打开Primer Premier5,点击File—New—DNA sequence,出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框

内(选择As），此窗口内,序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。

②此窗口可以链接到“引物搜索"、“引物编辑"以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索

框，选择“PCR primers”,“Pairs”,设定搜索区域和引物长度和产物长度.在Search Parameters里面，可以

设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物

电泳跑得较散，所以可以选择 300~500bp。

③点击OK,软件即开始自动搜索引物，搜索完成后,会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）

排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中,显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物

的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况: 3'不要出现连续的3个碱基相连的情况,比如

GGG或 CCC，否则容易引起错配.此窗口中需要着重查看的包括：T

m

应该在55～70度之间,GC％应该在45％～

55％间,上游引物和下游引物的T

m

值最好不要相差太多，大概在2度以下较好.该窗口的最下面列出了两条引物

的二级结构信息，包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体和错误引发位置.若按钮显示为红色，表示存在该二级结

构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构,即这几个

按钮都显示为“None”为好.但有时很难找到各个条件都满足的引物,所以要求可以适当放宽，比如引物存在错

配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于

Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能,但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.

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⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物,然后在菜单栏,选择

File-Print—Current pair,使用PDF虚拟打印机,即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息.

3、用Oligo验证评估引物

①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中,该序列已经被保

存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，

点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框,输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可,而引物

长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游

引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze

菜单中各种强大的引物分析功能了。

②Analyze中,第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物

的T

m

值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算,会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中

还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚

合反应，因此此项绝对值应该小些,最好不要超过9。

③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析,可以选择上游引物或下游引物,分析上游引

物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，即上下游引物之间的二聚体形

成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计

的引物形成的二聚体是不稳定的,即其Delta G值应该偏低,一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超

过3个.Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。

④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样,Delta G

值不要超过4。5kcal/mol,碱基对不要超过3个.

Analyze中第四项为Composition and T

m

，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和

Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40%～60％，而且上下游引物之间的GC％ 不要相差太大。Tm值共有

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3个,分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋

C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，T

m

值可以控制在50～70度之间。

第五项为False Priming Sites，即错误引发位点,在Primer5中虽然也有False priming分析，但不如oligo

详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率,一般的原则要使误引发效率在100以下，当然有时候正

确位点的引发效率很高的话,比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。

⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR",在此窗口中，是基于此对引物的PCR反应Summary,并

且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级

结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较

小，基本可以接受.

⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print,打印为PDF文件保存,文件中将会包括所有Oligo软件中已经打

开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口,可以保留引物信息窗口、

二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话)和PCR窗口。

4、引物确定后,对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序

列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。

二、引物设计过程中的心得

1、Primer 5.0搜索引物

①Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加

个酶切位点什么的。

②PCR Product size最好是100－500bp之间,小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来,条带很模糊，

不好看。至于上限倒也不必要求苛刻.

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③Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High,GC含量一般是40－60％。其

它参数默认就可以了.

④搜索出来的引物,按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估.当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你

可以不选择它,或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端≥2个G或C，这样的引

物应作为次选，没得选了就选它.对于这样的引物，如果其它各项指标还可以,我喜欢在引物末端去掉一个不满意

的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。

2、Oligo 6.0评估引物

①在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable

3’—Dimer绝对值应小于4。5kcal/mol， The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol

跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer overall 6。

7kcal/mol没有问题.

②Hairpin Formation根据黄金法则

③False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。

④在PCR栏，丁香园战友感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索

条件的时候,退火温度为其数值加减2的范围就可以了。

⑤Internal stability很重要:我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过

于稳定。 下图引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解:把一滴水放到

大海里,这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定.

3、其他

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①两个评价系统不一样，丁香园战友感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，一般按效率排序，再

结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里,退火温度也不一

样。

②3端的二聚体应该避免,这个要看退火温度决定,一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，

一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（丁香园战友观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。

③丁香园战友感觉3端有A无A影响不大,3端有T是不是一定不行，不见得。软件是评估，法则也不是没

有例外，不是1＋1＝2那么确定。

④错配和二聚体谁轻谁重，丁香园战友觉得“到致命的程度"谁都重要，在设计的时候，尽量两个都不得罪。

⑤GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性,3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。

所以丁香园战友设计引物的时候，会尽量避免这样的情况出现。