2024年4月10日发(作者：)

1.引物设计的基本原则是什么？引物设计的下列原则供您参考：1)引物最好在模板cDNA

的保守区内设计。2)引物长度一般在15-30碱基之间。3)引物GC含量在40%-60%之间，Tm值

最好接近72℃。4)引物3′端要避开密码子的第3位。5)引物3′端不能选择A，最好选择T。

6)碱基要随机分布。7)引物自身及引物之间不应存在互补序列。8)引物5′端和中间△G值应

该相对较高，而3′端△G值较低。9)引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。10)扩增产

物的单链不能形成二级结构。11)引物应具有特异性。2.常用引物设计软件有哪些？常用的

软件有Oligo6和PrimerPremier5.0。引物设计软件是根据引物设计的指导意见设计而成。

其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。引物设计软件的缺点是，

有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。金斯瑞为您提供以下引物设计相关软件：

引物计算工具引物设计工具测序引物设计软件Real-timePCR引物设计软件3.文献上找到的

引物和探针序列能否直接使用？通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，

最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用引物设计软件对引物探针的二

级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。4.如何计算引物的Tm值？

Tm值的概念：DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，亦即DNA变性过程中，

紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度(Tm)。金斯瑞采用以下方法计算Tm

值：长度为20mer及以下的引物，Tm计算公式为：Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)。但这个公式

只适用于14~20个碱基的引物，引物的TM值还与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲溶液的离

子强度等有关。对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm=0.41(%ofGC)–675/L+81.5

注：L：引物碱基数；%ofGC：引物GC含量；%ofGC=GC个数/引物总碱基数5.常见的引

物修饰的有哪些?修饰说明

磷酸化（Ph

osphorylati

on）

生物素（Bi

otin）

地高新（Di

5'磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反应。3'磷酸化可抗3

'外切酶消化的相关实验中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应。

引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分

离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。

地高新经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置，杂交的地高新探针可以

goxigenin）由抗地高新抗体来检测。地高新标记的探针可用于各种杂交反应，如DNA-DNA杂

交（Southernblotting）、DNA-RNA杂交（Northernblotting）、斑点杂交（Dot

blotting）、克隆杂交、原位杂交以及酶联免疫分析（ELISA）。

主要用C6-dTaminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与

内部氨基修

主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接（如碱性磷酸酶），目前提

饰

供内部氨基修饰介导的dT-Dabcyl、dT-Biotin和dT-Digoxingenin修饰。

可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在DNA芯片（DNAMicroarray）和多重

标记诊断系统。目前提供5'C6氨基修饰和5'C12氨基修饰两种，前者可用于连

5'氨基修饰

接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物，后者用于亲和纯化基团的连

接和一些荧光标记，尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。

目前提供3'C6氨基修饰。它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5'端可

3'氨基修饰用高度敏感的32P或荧光素标记的同时3'可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，

3'修饰可以抑制3'外切酶酶解，从而可用于反义实验。

5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物

素。例如可以在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下来制作巯基连接的荧光探针。5'

的巯基修饰主要用5'巯基修饰单体（5'-Thiol-ModifierC6-CEPhosphoramidite或

巯基（Thiol）

Thiol-ModifierC6S-SCEPhosphoramidite）。用5'-Thiol-ModifierC6-CE单体

修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基（trityl），而Thiol-ModifierC6S-SCE

单体修饰后须用DTT将二硫键还原成巯基。

Spacer可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作

用，主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。C3spacer主要用于模仿核糖的3

间臂（Spac

er）

'和5'羟基间的三碳间隔，或"替代"一个序列中未知的碱基。3'-SpacerC3用于引进

一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。Spacer18常用于引进一

个强亲水基团。

硫代（Phos硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。您可以选择全硫代，