中药制剂毛萼乙素对免疫球蛋白类别转换的作用

2024年5月29日发(作者：)

中药制剂毛萼乙素对免疫球蛋白类别转换的作用

任建婷;张洪信;陆顺元;顾鸣敏;王铸钢

【摘 要】Objective To investigate the effects of Eriocalyxin B (EriB) on

immunoglobulin class switch recombination (CSR).Methods B lymphocytes

(1B4.B6) were treated with lipopolysaccharide (LPS) and different doses (0

μmol/L,0.75 μmol/L,1.5 μmol/L and 2.0 μmol/L) of EriB,the proliferation of

these cells was analyzed by MTT and flow cytometry,the generation of

immunoglobulin,efficiency of CSR and expression of relevant genes which

play important roles in CSR were examined by ELISA,RT-PCR and Western

blotting respectively,and the regulation of NF-κB transcription via EriB was

determined by luciferase s With the increase of EriB

concentration,the proliferation and CSR of B cells were

inhibited the activation of NF-κB1 through blocking IκBα phosphorylation

and also directly repressed the transcription level of NF-

κsion EriB could inhibit CSR through repressing the activation of

NF-κB signaling pathway.%目的 研究中药制剂毛萼乙素(EriB)对免疫球蛋白类别

转换(CSR)的作用.方法 以不同剂量的EriB(0、0.75、1.5和2.0 μmol/L)处理脂多

糖(LPS)刺激下的B淋巴细胞系1B4.B6细胞,采用MTT和流式细胞术检测细胞的

生长状态,并分别采用ELISA、RT-PCR和Western blotting方法检测免疫球蛋白

的产生及其CSR的效率以及CSR相关基因的表达水平,采用报告基因法检测EriB

对NF-κB的转录调控作用.结果 随着EriB浓度的升高,B细胞增殖及CSR均出现障

碍.进一步实验证实EriB通过抑制IKKα的活性阻断IκB磷酸化,进而抑制NF-κB1

活化入核；同时直接抑制NF-κB1的转录从而导致其表达水平降低.结论 EriB可通

过NF-κB信号通路抑制CSR的发生.

【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》

【年(卷),期】2013(033)007

【总页数】6页(P949-954)

【关键词】毛萼乙素;免疫球蛋白类别转换;NF-κB信号通路

【作 者】任建婷;张洪信;陆顺元;顾鸣敏;王铸钢

【作者单位】上海交通大学基础医学院医学遗传学教研室,上海200025;上海交通

大学医学院附属瑞金医院实验医学研究中心,上海200025;上海交通大学医学院附

属瑞金医院实验医学研究中心,上海200025;上海交通大学基础医学院医学遗传学

教研室,上海200025;上海交通大学基础医学院医学遗传学教研室,上海200025;上

海交通大学医学院附属瑞金医院实验医学研究中心,上海200025

【正文语种】中 文

【中图分类】R967

中医药的应用在我国有着几千年的悠久历史，很多中药具有良好的抗肿瘤及抗炎症

效果。随着医学的发展，对中草药的研究采取了现代化的手段，许多中药的有效组

分被成功分离提取并广泛应于临床。毛萼乙素(Eriocalyxin B，EriB)是从分布于我

国西南部的常绿植物疏花毛萼香茶菜(Isodon eriocalyx ora)中纯化得到

的一种对映贝壳杉烷类化合物。在民间，该中药用于抗炎症和抗菌，可以治疗扁桃

体炎、咽喉炎、慢性支气管炎等感染性疾病，也用于治疗红斑狼疮、类风湿性关节

炎等自身免疫性疾病。研究［1－3］表明，EriB对一些肿瘤细胞株表现出非常强

的生长抑制作用，并能抑制核转录因子(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号通

路的活化。

NF-κB蛋白家族是一种多效性的转录因子，可以与多种基因启动子部位的κB位点

发生特异性结合，从而调控其转录表达。其受氧化应激、细菌脂多糖

(lipopolysaccharide，LPS)及细胞因子等多种刺激而活化后，能调控前炎症性细

胞因子、细胞表面受体、转录因子、黏附分子等生成，参与机体防御反应、组织损

伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递［4］。据文献报道，

NF-κB1/p50 可调控活化诱导的胞嘧啶脱氨基酶(activation-induced cytidine

deaminase，AID)的表达［5］，而后者在免疫球蛋白类别转换(class switch

recombination，CSR)中起着不可或缺的作用［6－8］。此外，NF-κB1/p50 还

直接参与免疫球蛋白IgG3的类别转换过程［9－11］。

本文通过研究EriB对B细胞的增殖及凋亡的作用及其是否通过NF-κB通路影响

CSR过程，旨在进一步探讨EriB在免疫方面尤其是在抗体类别转换中的重要作用，

以期为深入地了解其作用机制提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

EriB(由上海血液研究所惠赠)溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，

配制工作液浓度为1 mmol/L，－20℃保存;LPS和 β-actin抗体购自Sigma公

司;NF-κB1抗体购自Stressgene公司;实验中所用酶类均购自Takara公司;TRIzol

购自Invitrogen公司;GFP荧光二抗购自MP公司;ELISA Kit购自Southern

Biotech公司;Western杂交NC膜购自Whatman公司;双荧光素酶报告基因检测

试剂盒购自Promega公司。

1.2 细胞培养

1B4.B6细胞株由本实验室冻存，复苏传代后同样调整浓度为2×106/mL。阴性对

照组不加药，实验组均加LPS(终浓度为20 μg/mL)，EriB浓度分别为0、0.75、

1.5 和 2.0 μmol/L;均置于 1640 培养液(20%胎牛血清)中，在含5%CO2的37℃

温箱中培养。

1.3 四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力

取对数生长期细胞接种于96孔板(每孔1×104个细胞)，LPS(终浓度为20 μg/mL)

刺激，加入EriB处理(终浓度分别为0、0.75、1.5 和 2.0 μmol/L)，每个样品设4

个复孔。分别于0、24、48和72 h，向每孔中加入0.1 mg的MTT，37℃下孵

育4 h后离心、弃尽上清，每孔加入100 μL DMSO，在振荡器上振荡混匀。置于

酶标仪上检测波长570 nm处的吸光度值，参考波长630 nm处测量标本的吸光

度值，并绘制细胞生长曲线。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率

加入LPS及不同浓度EriB培养的1B4.B6细胞培养48 h后，离心收集悬浮细胞，

弃上清后用冷PBS洗涤细胞2次。用1×binding buffer重悬细胞浓度至1

×106/mL，取 100 μL 细胞加入 5 μL AnnexinⅤ和5 μL 碘化丙啶(propidium

iodide，PI)混匀后避光室温放置15 min。每管加入400 μL的1×binding buffer，

1 h内用流式细胞仪检测。

1.5 RT-PCR检测CSR相关基因的表达

取经过LPS和不同浓度EriB刺激48 h后的细胞，3 000 r/min离心5 min，弃上

清，提取总RNA进行定量，取1 μg RNA样品，采用Takara公司的AMV反转

录酶按说明书配置反应体系，进行反转录反应。PCR反应视不同基因特异引物和

条件进行，以等量未经反转录反应的RNA为对照，排除基因组污染的影响，以 β-

actin为内参照，取 5 μL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系

统上观察目的片段。引物采用Primer premier 5.0软件包根据序列资料自行设计，

均由上海生工生物工程公司合成，引物浓度为10 mmol/mL，所用引物如表1所

示。

表1 PCR引物序列Tab 1 PCR primer sequences基因 引物序列IμCμ 上游:5'-

CTCTGGCCCTGCTTATTGTTG-3'下游:5'-AATGGTGCTGGGCAGGAAGT-3'Iγ1

Cγ1 上游:5'-GGCCCTTCCAGATCTTTGAG-3'下游:5'-

GGATCCAGAGTTCCAGGTCACT-3'IμCγ2a 上游:5'-

CTCTGGCCCTGCTTATTGTTG-3'下游:5'-GCCACATTGCAGGTGATGGA-3'Iγ3

Cγ3 上游:5'-GTGGATCTGAACACACACAAC-3'下游:5'-

CTCAGGGAAGTAGCCTTTGACA-3'β-actin 上游:5'-

AACGAGCGGTTCCGATGCCCTGAG-3'下游:5'-TGTCGCCTTCACCGTTCCAGTT-

3'NF-κB1/p105 上游:5'-GTCTAAATGCCATCCACATA-3'下游:5'-

GAGTTTGCGGAAGGATGT-3'Aid 上游:5'-TTCAAAAATGTCCGCTGGG-3'下

游:5'-AGCCCTTCCCAGGCTTTGA-3'Cox-2 上游:5'-

TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3'下游:5'-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3'Bcl-2

上游:5'-GCGCAAGCCGGGAGAACA-3'下游:5'-AGACGTCCTGGCAGCCAT-

3'Bcl-xl 上游:5'-CATCCAAACTGCTGCTGTGG-3'下游:5'-

TTATCTTGGCTTTGGATCCTG-3'CycD1 上游:5'-

CCTGTGCTGCGAAGTGGAAAC-3'下游:5'-AAATCGTGCGGGGTCATTGC-3'p21

上游:5'-GCCTTAGCCCTCACTCTGTG-3'下游:5'-AGCTGGCCTTAGAGGTGA-3'

1.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测免疫球蛋白的表达

1B4.B6 细胞经 LPS(终浓度为 20 μg/mL)刺激培养，同时加入不同浓度(0、0.75、

1.5 和 2.0 μmol/L)EriB处理48 h后收集细胞培养上清液，采用小鼠免疫球蛋白

Isotype Kit测定免疫球蛋白 IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3的含量，取5

个复孔上清的平均值后，分别以各组中LPS刺激组为基础值计算出比例并作图。

1.7 Western blotting检测免疫球蛋白的相对表达量

1.B4.B6 细胞经 LPS(终浓度为20 μg/mL)及不同浓度(0、0.75、1.5 和 2.0

μmol/L)EriB 处理 48 h后，用 Biovision公司的 Nuclear/cytosol Fractionation

Kit分离核蛋白与胞质蛋白。分别取等量的总蛋白、核蛋白、胞质蛋白加入适量

6×loading buffer，100℃变性5 min后上样。10%SDS-PAGE电泳，上层胶电

压为70 V，下层胶为90 V，电流300 mA转膜1.5 h。封闭液(含5%牛奶的PBS)

室温封闭1～2 h。加入封闭液稀释的一抗4℃孵育过夜。实验用一抗包括兔抗

NF-κB/p50(1∶1 000)、兔抗 p65(1∶1 000)、兔抗 IKKα、兔抗 pIKK、鼠抗

IκBα、鼠抗 pIκBα、羊抗actin(1∶1 000)及羊抗 laminb B(1∶500)。PBST 洗膜

3次，每次5 min，加封闭液稀释的相对应种属的IRDyeCW800-conjugated二

抗(1∶10 000)室温孵育45 min，PBST洗膜4次后Oddsey红外扫描仪扫描。

1.8 报告基因实验检测NF-κB1的表达

PCR扩增NF-κB1的ATG前面2.4K的序列，测序正确后克隆至pGL3-Basic载

体的BglⅡ和HindⅢ位点，所用的上游引物为5'-CCCAAGCTTTGAACAC

CTGTACTGGCCTT-3'，下游引物为5'-GAAGATCTAA TGTGGTTTATCTGTGAT-

3'。1.B4.B6 细胞培养至对数生长期，用PBS洗涤2次，将细胞浓度调整到

2×107/mL，取 500 μL 细胞加 15 μg 报告基因质粒及1 μg内参质粒 pRL-TK，

250 V(975Ω)电转后加 LPS(20 μg/mL)及不同浓度EriB继续培养，48 h后收细胞，

采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

使用Excel 2000软件进行统计学分析。计量资料以表示，各组间比较采用方差分

析。P＜0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EriB能够抑制LPS诱导的1B4.B6细胞增殖并促进其凋亡

细胞在静息状态下NF-κB以无活性状态存在于细胞质中，为研究EriB对NF-κB

信号通路的作用，实验中加入LPS刺激细胞的增殖并诱导NF-κB信号通路的活化。

1B4.B6细胞经 LPS(20 μg/mL)及不同浓度(0、0.75、1.5 和 2.0 μmol/L)EriB 刺

激培养不同时间点(0、24、48和72 h)后收集细胞并进行活细胞计数，以0 h值

为基础值计算比率，发现随着EriB浓度的升高活细胞比例显著下降(图1A)。MTT

检测也以0 h值为基础值计算比例，结果显示EriB能够抑制由LPS刺激引起的细

胞增殖(图1B)，提示EriB对LPS刺激的B细胞生长有一定的抑制作用。Annexin

V/PI双染色流式细胞术检测结果显示EriB可显著诱导1B4.B6细胞凋亡(图1C)。

为深入探讨EriB对B细胞增殖凋亡的作用机制，采用RTPCR法检测在细胞增殖

凋亡过程中发挥重要作用的基因，结果显示Bcl-2、Bcl-XL及cyclinD1的表达随

着EriB浓度的升高均有不同程度下调，而促凋亡基因p21则有一定程度上调(图

1D)。

2.2 EriB通过抑制 CSR影响免疫球蛋白的产生过程

ELISA法检测结果显示:在EriB的作用下，上清中各种免疫球蛋白亚型的含量较对

照明显减少，其中IgG3下降最明显(图2A)。为进一步探究上清中免疫球蛋白减少

的原因，采用RT-PCR检测相关转录本的表达情况。每组分别取相同量的细胞抽

提RNA并进行反转录，用相应引物在相同条件下扩增DNA片段，结果表明IgM、

IgG1和IgG3的胚系转录本(Iμ-Cμ，Iγ1-Cγ1，Iγ3-Cγ3)的表达水平在 EriB 作用

前后无显著差异，说明EriB不影响胚系转录本的表达水平;但IgG1、IgG2a、

IgG2b和IgG3的类别转换后转录本(Iμ-Cγ1、Iμ-Cγ2a、Iμ-Cγ2b、Iμ-Cγ3)均有

不同程度减少(图2B)。此外，EriB可有效抑制Aid的表达(图3)，而Aid在CSR

过程中发挥重要作用。以上数据提示EriB能够通过抑制CSR而影响免疫球蛋白的

产生。

2.3 EriB通过抑制 IKKα 的活化有效抑制 NF-κB信号通路活性

在基础状态下，NF-κB蛋白通常以同源或异源二聚体的形式与IκB结合存在于胞

质中，当细胞受到刺激后，IκB降解，活性NF-κB被释放并移位于胞核内，调节

靶基因的转录活性，故胞核内NF-κB蛋白质的表达可认为是 NF-κB激活的标志。

Western blotting检测结果表明EriB处理后细胞的总蛋白、胞质蛋白及核蛋白中

NF-κB1的表达水平均明显下降(图 4A)。RT-PCR结果也证实，NF-κB下游基因

Cox-2的表达水平随着EriB的增加也有一定程度下降(图4B)。IKK的活化是NF-

κB激活途径中的限速步骤，只要IKK的激酶活性受到稍许减弱就会显著抑制IκB

的降解和NF-κB的激活。因此我们对相关蛋白进行了检测，结果显示一定浓度的

EriB刺激下，被LPS刺激诱导的IKKα磷酸化受到了抑制(图5)，提示EriB可以通

过抑制IKKα的活化，从而抑制NF-κB 的活性。

2.4 EriB能在转录水平抑制NF-κB1的表达

如图4A所示EriB的处理使NF-κB1在1B4.B6细胞各组分中表达均有下降，而

RT-PCR结果也表明在EriB作用下NF-κB1在RNA水平表达量减少(图6A)。为

了进一步研究EriB在转录水平对NF-κB1的抑制作用，用报告基因法检测EriB对

NF-κB1 promoter的调控作用。结果显示，随着 EriB浓度的增加，NF-κB1

promoter驱动的荧光素酶活性降低(图6B)，提示EriB可通过抑制NF-κB1的转

录调控其表达。

图6 EriB抑制NF-κB1的转录Fig 6 EriB inhibits transcription of NF-κB1

注:-PCR检测EriB作用下NF-κB1在RNA水平的表达;B.将NF-κB1的

promoter克隆于pGL3-basic载体，加入LPS和EriB处理后进行荧光素酶活性

检测。图为药物处理的各样本相对于空白组的值。①P＜0.05与LPS组比较。

3 讨论

CSR是一个非常复杂的过程，以非同源末端连接重组的方式使重链(H链)基因簇中

的S区(switch region)与下游其他S区基因重组，并将两个S区之间的DNA序

列环出，使已完成基因重排的VDJ片段被置于一个新的恒定区片段上游，从而生

成可变区相同而恒定区不同的免疫球蛋白［12，13］。AID酶在此过程中发挥重

要作用，它使单链DNA中的A脱氨基成为U，然后将U水解去掉从而完成DNA

链的打开，以完成环状DNA的切除。此外还有几十种蛋白在该过程中发挥重要作

用，但其确切机制尚未完全阐明［14］。据文献报道，NF-κB1/p50能够调控

Aid的表达，当p50缺失时Aid酶的含量明显降低，而且NF-κB1/p50在IgG3

发生CSR的过程中与重链DNA的Sγ3上游序列结合，其功能可能是募集核A位

蛋白(S nuclear A-site protein，SNAP)和核B位蛋白(S nuclear B-site protein，

SNIP)等类别转换所必需的蛋白因子，促使DNA链解链，从而促进IgG3发生类

别转换。

EriB属于二萜类化合物的一种，该中药在民间用于抗炎症和抗菌。研究证实它可

以抑制NF-κB信号通路，并通过上调活性氧(reactive oxygen species，ROS)水

平改变细胞的氧化还原状态，继而影响胞内许多对氧化应激敏感的信号通路以及转

录因子的活性。此外，EriB还能通过靶向关键信号通路，选择性调控Th1和Th17

细胞，发挥强有力的抗感染作用［15］。

LPS可以在没有其他细胞因子辅助的情况下直接刺激成熟B细胞的增殖与分化，

并活化NF-κB信号通路。本实验中，首先将LPS作用于1B4.B6细胞株，刺激细

胞生长并诱导发生CSR，接着加入不同浓度的EriB处理细胞，结果细胞的凋亡增

加、增殖减少。国内外学者研究［1－3］发现，EriB可以促进多种T淋巴细胞或

B淋巴细胞的凋亡，针对它的这种特性，一些研究者将其应用于肿瘤的治疗中。已

经有研究［2，3，15］证明，EriB 有很强的抗白血病效应，能够显著抑制多种肿

瘤细胞的生长。我们发现，随着EriB浓度升高及时间推移，凋亡1B4.B6细胞数

不断增加并呈现剂量依赖性，因此可认为这种凋亡现象是由EriB引起的。

ELISA结果显示，在EriB的作用下上清中各种免疫球蛋白的含量均明显减少，其

中IgG3下降最为明显;RT-PCR检测结果显示，经不同浓度EriB作用后IgG3及其

他型的CSR转录本表达量下降，而胚系转录本的表达量无明显差异，另外Aid的

表达量也下降，均说明EriB对CSR有抑制作用。Western blotting及报告基因

法则显示EriB可以通过对NF-κB信号通路的调控参与CSR，主要通过以下两种机

制抑制NF-κB信号通路的活化:①EriB通过抑制IKKα的活性，阻断 IκBα 的磷酸

化，进而抑制 NF-κB的活化入核;②EriB通过抑制NF-κB1的转录来调控其表达水

平。

中医药有2 500多年的历史，从已知的对某些疾病有效且毒性较低的中草药中提

取天然化合物，是目前研发有效的多靶点药物以扩大临床药物测试药库的新思路。

近年的研究中发现EriB具有很强的抗白血病效应，本研究对EriB这一中药单体在

抗体类别转换中的作用机制进行阐述，有助于我们深入了解EriB在抗感染中的作

用，为更全面地开发该中药提供了新的实验证据。

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