2024年6月1日发(作者：)

Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。Pull-Down实验

是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知蛋白的

表达和相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。Pull-Down实验至少需要一

种纯化的标签蛋白（诱饵）用来捕获和“pull-down”靶蛋白（猎物）。

Pull-Down vs.免疫沉淀

Pull-Down实验是亲和纯化的一种形式，其与免疫沉淀十分类似，不同之处在于使用

诱饵蛋白代替了抗体。在Pull-Down实验中，带有标签的诱饵蛋白被特异结合该标签的固

相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。

含有固相化诱饵蛋白的次级亲和支持物可以与含有推测猎物蛋白的各种蛋白样品相互孵

育。如果缓冲液及样品条件与靶结合相互作用兼容，且诱饵蛋白在带有标签和被固相化时

仍然可以行使功能，那么存在于样品中的猎物蛋白就会结合到亲和支持物上。如果特异结

合相互作用的亲和性足够强，那么非结合的样品成分可以被洗涤掉，进而纯化形式的猎物

或诱饵-猎物复合体可被从支持物上洗脱下来。

诱饵蛋白固相化策略

1.依赖固相化抗体结合蛋白（例如蛋白A或蛋白G琼脂糖）的免疫沉淀形式显然对

pull-down实验不是很有效。必须使用其他亲和系统固相化诱饵蛋白（例如‘bait the

hook’）。如果有纯化的天然的诱饵蛋白，可将其用生物素进行标记或偶联一些其他小的

标签，以适用于现成的亲和树脂。即用型生物素化试剂及标记试剂盒（见目录第九节，281

页），可实现使用链亲和素琼脂糖树脂进行pull-down实验。

2. 如果被用作诱饵的蛋白是重组蛋白，那么其很可能会含有一个用于纯化的亲和标

签。这个融合标签就会成为该诱饵蛋白用于pull-down实验的基础。最常见的标签为谷胱

甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His），其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金

属螯合物亲和配体。接下来的试剂盒被优化用于这些特别的亲和系统。列于下面几页中的

Thermo Scientific GTPase Pull-Down和检测试剂盒，使用含有GST标签的特异GTPase

蛋白的下游效应子进行检测。

一、生物素标记Pull-Down实验

实验者须提供生物素化蛋白作为“诱饵”和表达互作靶标推测蛋白 （“猎物”）的细胞。亲

和体系是已知且特异的生物素-链亲和素的相互作用。生物素化蛋白作为“诱饵”捕获推测

的连接配体（即“猎物”）。在一个典型的pull-down实验中，被固定的诱饵蛋白在细胞裂

解液中孵育。经过指定步骤的漂洗后，“反应物”被选择性洗脱以进行凝胶分析或Western

印迹。因为生物素-链亲素和的互作连接亲和度较高，一般情况下猎物蛋白被洗脱掉，而生

物素化诱饵蛋白则仍保持固定在链亲和素琼脂糖树脂上，不被洗脱。链亲和素琼脂糖树脂