2024年6月12日发(作者:)
热带作物学报2011,32(5):866—869
Chinese Journal of Tropical Crops
中国水仙STK类抗病基因同源序列的克隆与分析
吴菁华,吴少华 ,杨 超
福建农林大学园艺学院.福建福州 350002
摘 要 根据丝氨酸,苏氨酸蛋白激酶类(seifne-threonine kinase.STK)抗病基因结构中的保守结构域设计简并引
物.以中国水仙的基因组DNA为模板.扩增获得4条STK类抗病基因同源序列。同源性分析表明,其均具有
STK保守结构域,与已经克隆的 J、 o、 10、Lectin等基因在氨基酸水平上的同源性为38.3%~68 。系
统进化树分析表明.它们可能是抗病基因的同源序列.这为进一步克隆中国水仙中STK类抗病基因提供依据。
关键词 中国水仙:丝氨酸,苏氨酸蛋白激酶(STK);抗病基因同源序列
中图分类号¥633.1 文献标识码 A
Cloning and Analysis of RGAs Genes Coding Serine/
Threonine Protein Kinase-like Proteins from
Nnrcissus tazetta var.chinensis Roem
WU Jinghan.WU Shaohua.YANG Chao
Department of horticulture,Fujina Agriculture and Forestry University,Fuzhou,F ̄jina 350002,China
Abstract Based on the conserved amino acid sequences of the motif of the Serine/Threonine(STK)protein
kinase-like proteins,the degenerated primers were designed and PCR was performed on genomic DNA of narsissus
and four DNA fragments were cloned.The analysis of homology indicated that they all had STK motifs.The
sequences of each RGA were compared with those of some known resistance genes(Pto,Xa21,LrlO,Lectin,etc.),and
the percentage of amino—acid identity ranged from 38_3%-68%.These provided the basis for further study on
cloning STK resistance gene in Narcissus tazetta var.chinensis Roem.
Key words Narcissus tazetta var.chinensis Roem.;Serine—threonine kinase;Resistance gene analog
doi 10.39696.issn.1000—2561.2011.05.016
水仙是石蒜科多年生鳞茎植物.其花色丰富.
1992年Johel等应用转座子标签法从玉米中成功地
部分种类具有宜人的香味.是世界各国广泛种植的 分离出第1个抗病基因Hml以来回.对植物抗病基
著名观赏兼药用植物f1]。原产中国的仅有一种,即 因克隆以及植物抗病基因作用机制的研究等方面均
中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis Roem.),
具有很大进展『3_5】 目前已从多种植物中分离出多
是法国水仙的变种.是中国传统十大名花之一。与
种抗病基因同源序列(RGA)t ̄.但大都集中在具有
欧洲水仙相比,中国水仙多花,花瓣白色、副冠黄 核苷酸结合位点及富含亮氨酸重复序列类(NBS—
色 福建是中国水仙的主产地.以漳州水仙久负盛
LRR)基因和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(STK)基因
名.畅销海内外。水仙在栽培中病害较多。导致传 这两类上 关于中国水仙抗病基因同源序列的克隆
统品种商品性状普遍退化.严重制约了中国水仙的
尚未见报道.本研究根据已报道的STK基因的氨
生产和发展.因此,培育抗病的中国水仙品种显得
基酸保守区域设计简并引物.对其STK类抗病基
尤为重要.而R类基因的克隆可为抗病水仙的育 因进行了克隆.这为进一步研究中国水仙的抗病基
种奠定基础
因资源和抗病机制奠定基础
水仙抗病基因的分离是深入了解水仙植物抗病
机理以及通过基因工程进行水仙遗传改良的前提
1材料与方法
随着分子生物学研究的不断深入.利用植物基因工
1.1材料
程手段辅助植物抗病育种显示出巨大潜力。自
以中国水仙‘金盏银台’嫩绿色叶片为材料。
收稿日期:2011-02—28 修回Et期:2011-04—30
基金项目:福建省自然科学基金计划资助项目(2009JO1066),福建省教育厅资助科技项目(JA07069)。
作者简介:吴菁华(1978年一),女,硕士,讲师。研究方向:园艺植物育种学。 通讯作者:吴少华。
第5期
1.2方法
吴菁华等:中国水仙STK类抗病基因同源序列的克隆与分析 一867—
的氨基酸残基序列可能属于STK蛋白激酶类 基
1.2.1 基因组DNA的提取 采用CTAB法提取中
因同源序列片段.分别命名为SSX1~SSX4
2.2 R类基因同源序列的比较和聚类分析 国水仙基因组DNA阴
1.2.2 PCR扩增与克隆 根据STK类抗病基因产
利用DNAMAN对获得的4个克隆进行分析.
都可以得到完整的氨基酸序列.并含有STK类抗
病基因所共有的保守区 在NCBI中用BlastX进行
物催化结构域I的保守氨基酸序列(FG V/U
SVYK/RG)和Ⅸ的保守氨基酸序列(DY/IYSF/YGV/I/
M)设计简并引物,STK1:5'-TYC/TGGIA/G/TIIGTI
TAC/TA/CA/GICG-3 : STK2: 5 一AC/TICCA/GA/
TAAIC/GA/rI1A/GTAIAC/TA/GTC一3 :由上海英骏生
物技术有限公司合成
以中国水仙基因组DNA为模板进行PCR扩
增。PCR反应条件为:94℃4 min:94℃30 S,
45℃30 S,72 oC l min,共35个循环:72℃10 min。
同时以双蒸水为模板.其它反应成分和反应条件均
相同,作为阴性对照,1.O%琼脂糖凝胶电泳检测
PCR产物 回收500 bD左右片段并连接到
pMD18一T载体,转化,挑取阳性克隆送往上海英
骏生物公司测序
1.2-3抗病基因同源序列遗传多样性及进化关系分
析 序列采用Blast程序进行相似性搜索.再利用
DNAMAN 6.0查找ORF并翻译成氨基酸序列.进
行氨基酸序列同源性分析
2结果与分析
2.1 R类基因类似序列的PCR扩增与克隆
利用引物STK1和STK2对中国水仙基因组
DNA进行扩增后,得到一条大小约500 bp的条带
(网1),经克隆后共获得500 bp左右预期大小片段
的阳性克隆21个 测序后.在NCBI中用BlastX
进行同源性比较.发现4个基因组DNA克隆编码
M 1
hp
2 000
1 000
750
500
100
M.DL2000 Marker;1.PCR扩增片段。
图1 目的基因PCR扩增
序列比对可知.SSX1可能编码的氨基酸残基与番
木瓜STK类蛋白激酶和尖叶蕉中受体样蛋白激酶
同源性最高.SSX3与SSX1的氨基酸残基相似程
度较高.也与番木瓜STK类蛋白激酶和尖叶蕉中
受体样蛋白激酶同源性较高 SSX2与玉米的STK
类蛋白激酶有一定的同源性.SSX4与欧洲榛子中
受体样蛋白激酶同源性最高
利用DNAMAN 6.0软件对4个克隆的氨基酸
残基序列与水稻R基因 (U37133)、番茄R基
因Pt0(U59316)、小麦抗叶锈病基因LrlO
(U51330)、拟南芥的外源凝集素蛋白激酶类基因
LectinfAB017067)的氨基酸序列进行氨基酸序列
同源性分析.结果表明.它们均具有丝氨酸/苏氨
酸蛋白激酶所共有的特征区域(图2),如催化亚区
Ⅱ和亚区Ⅷ以及蛋白激酶的其它催化区(I~Ⅳ
等) 与其他抗病基因相应区域的氨基酸序列相似
性比较可知.与 ,相似性为38-3 ~44.9 .与
0
相似性为38.7% 45-3%.与Lr10相似性为
残基序列和部分抗病基因的氨基酸序列比较
-
868- 热带作物学报 第32卷
38.3%~68.0%.与I ̄ctin相似性为40-3% 43.7
(表1)。用DNAMAN软件对Pto、Xa2,、 rJ0和
Lectin进行分子系统进化树分析,结果见图3。由
的『】01 本文以中国水仙基因组DNA为模板获得了4
个STK类抗病基因同源序列.表明利用这种方法
也可以从中国水仙中获得抗病基因的同源序列 同
时.本研究扩增得到的4个STK类抗病基因同源
图3可知.4个克隆的中国水仙氨基酸序列可以分
一 J 3 , 2 一-一
成两类:SSX1、SSX3和SSX4归为一类.SSX2单
独为一类。它同小麦抗叶锈病基因 r 0同源性
较高,达到68%。植物凝集素与植物的抗病反
应相关,其可能来源于中国水仙中一个类似的抗
病基因
表l 4个中国水仙RGA序列与已知植
物抗病基因氨基酸相似性分析,%
lO07 ̄ 7∞,o 407./o
图3水仙STK类RGA s同源序列和
部分R类基因的分子系统进化树
3讨论
蛋白激酶(protein kinase,PK)编码的蛋白中均
存在一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)结构域,是
植物5类抗病基因中的一类。这类基因包括Pro、
10、Xa21和Lectin基因等。试验证明激酶介导
的信号传导在植物抗病反应中起重要作用[8-91。根
据R类基因结构相似性和保守结构域设计引物.
从植物DNA或cDNA中获得抗病基因同源序列.
植物细胞中第1个受体激酶玉米zmpkl是以动物
蛋白激酶保守结构域为基础用PCR方法克隆得到
序列用Specialized BLAST中的保守区对所得氨基
酸序列进行保守区域分析.结果表明.它们均属于
STKc超家族.具有sTK抗病基因的多个活性位
点,如ATP结合部位、底物结合部位等。并与其
他物种STK类家族相似度较高.与已克隆的含此
结构域的抗性基因相应区段也有较高的相似性.这
为进一步寻找中国水仙中含STK结构域的抗性基
因提供依据
近些年利用R类基因的保守区域设计PCR
特异简并引物,已从多种植物中扩增出RGAs.
该方法为R类基因的获得提供了一条简捷有效的
途径嘲 但利用这种方法分离R类基因也有自身的
一
些缺点,如分离同源基因具有很大的随机性.获
得片段有的不能翻译为完整的氨基酸序列.可能其
属于基因组中的非编码区域:有的含有保守结构
域,但不与植物的抗性有关 现有的关于RGA大
多数都是从基因组中分离的.由于RGA是个庞大
基因家族.有一部分RGA可能有一些是不表达的
基因.所以cDNA中分离的RGA是抗病候选基因
的可能性更大。但是一个部位、一个时期表达所
有的RGA是不可能的.要获得较多的RGA必须
从不同的cDNA中分离RGA.这又大大增加了基
因克隆的工作量.如何有效的分离RGAs仍需进
一
步深入研究
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责任编辑:赵军明
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