2024年4月10日发(作者:)
PCR引物设计的11条黄金法则
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的
同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列
就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其
延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。
GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能
相差太大。另外,上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度,
即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值
5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为
55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简
并,会影响扩增的特异性与效率。
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5.引物3′端不能选择A,最好选择T。
引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使
在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,
G、C错配的引发效率介于A、T之间,所以3′端最好选择T。
6.碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易
导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的
分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,
因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身
复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4
个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer
与Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高(应小于
4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能
正常进行。
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