2024年5月7日发(作者：)

qPCR操作及问题分析

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一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和

引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防

在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反

应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDN

A，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当

然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行

优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：

1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。

2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。

3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！

4. 所有成分加完后，离心去除气泡。

5. 每个样品至少3个平行孔。

参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是

ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染

料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，

提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture

里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、

延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR

@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判

断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在

产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。

3. 仪器设置

所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置

（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：

A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。

B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDN

A为模板进行。

C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。

D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的

设置。

E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备