2023年12月29日发(作者：)
在奶油生产特伦蒂诺奶酪中嗜冷微生物种群的变化
摘要：本研究的目的是在牛奶提取的特伦蒂诺基粒级乳酪制造中研究嗜冷微生物的发展. 138份分离原料全脂牛奶,奶油色和脱脂牛奶样本是通过随机扩增DNA多态性型负荷的筛选和代表株各生理适应情况特征是16S RRNA局部特征基因测序及酶活性。一般看法都被隔离在奶油样品而链球菌科和肠在牛奶样品中。莫拉氏菌科和醋酸杆菌科被同时发现在奶油和牛奶的样品里。
超过80%的嗜冷菌在37 C能生长。所有醋酸杆菌科和变形菌门生物的一半牛奶蛋白水解活性在琼脂显示即使低温如10 C。所有链球菌科和一些肠杆菌科显示酸化活动而且几乎所有的肠杆菌属(莫拉氏菌科)显示分解脂肪的活动。
即使嗜冷细菌不占统治地位的微生物集团在原料奶中,他们的总数在提取过程中的增加也成为目前连同乳酸细菌中之一。他们的酶活可能在奶酪制作中在决定奶的质量中起着关键的作用。
关键词：嗜冷微生物 提取 基粒奶酪介绍
001
简介
基粒特伦蒂诺是一个属于基粒联合体的煮硬奶酪,他经过一个几乎需要两年成熟的时期。它是产生于特伦蒂诺地区（位于意大利北部的高山地区)原料牛奶来源地 (n.1269歧化松香,1955年10月30日)。大部分来源于两个不同的乳品牛奶按大约在1:1的比例混合。首先被运送到乳制品工厂在晚上干乳酪制造前并且放在大的经9-11小时提取过程发生的浅容器。经一夜的发酵, 部分脱脂牛奶浮在奶油容器之上并从奶油脂肪手动排出放进一个大桶里。一块大约相等的全脂牛奶来自早晨在干乳酪制造前加入脱脂牛奶的鲜奶。奶油用于黄油生产。经过一夜的发酵，牛奶自发提取发生温度保持在15至17 0 C去避免乳酸细菌增长过快。
提取过程的优化是至关重要的对脂肪比例的牛奶酪蛋白(Zucchetto和Neviani,2006),
但也有重要的微生物将来要为后果付出代价因为一些微生物的出现在原料奶与脂肪小滴将被移除。最近分子社区指纹方法的发展提供了一个复杂的微生物生态系统观点如原料奶(Lafarge et al.,2004; Gorier et al., 2004)。生牛奶含有细菌例如乳酸菌株那就会有技术的相关性, 而且嗜冷中的像假单胞菌、不动杆菌、肠道杆菌,芽孢杆菌、白喉杆菌梭状芽和棒状杆菌(Dugan and Boor, 2003; 葡雅莉, 2006),他们产生耐热胞外酶有相当大的潜力(Demiurges et a1.,1997; Cousin,1982)。耐冷菌能够成长和破坏牛奶或奶油的发酵。尼尔森(2002年)表明, 通过耐冷菌产生蛋白酶和脂肪酶在乳制品中可以造成缺陷。作为蛋白酶能破坏蛋白胶束,最后凝结物不能紧凑也更脆弱(Manfred and Sassari, 1989)。嗜冷细菌脂肪
酶可能引起甘油三酯在脂肪中的水解和品味降低很大程度上的平等——即发展储存的感官性状的奶类制品,如黄油和奶酪(Craven and Macauley,1992; Hilton, 2006)。
微生物种群动力学的硬干酪成熟过程中和成熟是众所周知,但知识的发展和嗜冷微生物的表征仅限于比较在冷冻及不冷藏牛奶与工作嗜冷数量在提取中仍然缺乏间的比较。研究提取过程的处理主要集中于物理化学及流变特性的牛奶(Ma and Baranov, 2000)或在不同提取条件(Malaccan et al., 2008)。微生物种群的发展,研究了在自主提取只有体外(Bellagio et
a1.,1969)而病原体的行为进行了分析,研究了接种菌株不同提取条件(Carminative et al.,
2008)。微生物在实际系统中提取动力学被Planar 等 (2007) 进行了研究认为只有板计数。
在本研究中,我们提及对前、后微生物自发的从原全脂牛奶采集原料中的提取在晚上奶油和脱脂奶用来制造基粒特伦蒂诺奶酪在位于非谷的乳品 (Trento、意大利)。特别注意的是造成目前在原料奶嗜冷微生物前、后的剩余部分。为了了解嗜冷数量在牛奶中提取之前和之后的构成, 共有138个部分嗜冷微生物被分离在四个不同的干乳酪制造过程。具有基因的隔离技术(RAPD-PCR排序); 他们的脂解和蛋白水解特点和他们的卵磷脂酵素活动是通过筛选评价方法对固体介质筛选被扎哈罗夫 and Helper设计(2007)。既然现在生长媒介和培养条件仅仅选择细菌数量的一小部分, 它仍有待确定是否从牛奶和奶油样品所含的微生物种群的代表单株菌株出现在他们中间。尽管这种基于培养依赖方法使用（移植和隔离）是一个先决条件,研究单一菌株组成群落和他们的表现型特征。
2材料和方法
2.1 牛奶，奶油和样品收集装置
所有的全脂牛奶（wm），脱脂牛奶（SM）和（C）样本收集奶酪工厂生产粒特伦蒂诺位于非谷（特伦托，意大利）。原牛的牛奶收集三个农场，配备了自动挤奶设施，并运到奶酪厂由一个单一的卡车。总鲜奶的奶制品进行卡车提供了一个真空泵（avm12，scram美国公司，”迪维波利，维罗纳，意大利）和牛奶量的方式记录的磁感应测量系统。牛奶是重力分离约15
- 17℃平面钢不包括增值税（2米×7.5米的深度25厘米）。经过一夜的休息10小时左右，脱脂牛奶分数排出的平板底部增值税和收集在一个铜瓮，保持温和搅拌直到奶酪开始后，除了上午全脂牛奶。顶端部分是奶油和排出后的脱脂牛奶但在塑料刻度弓记录卷。所有实验推广与牛奶收集在连续三天的连续四周（12奶酪制作过程）。大量罐装原料牛奶和奶油的原料搅拌前采样。特别是引起轻微的上下移动以避免微生物沉积在霜层。后停止搅拌，一升牛奶或奶油，测量的校准，采集的标本被分配分为2毫升量聚丙烯（扎尔施泰特，numbers，德国）。
样品微生物分析在液氮中保存后立即收集和保存在冰箱fryo4101t在-80℃（新不伦瑞克科学有限；爱迪生，新泽西州；美国）直至分析。之前，（通常是一个星期后取样），样本解冻搅拌水浴40℃解冻。从来没有超过5分钟。
化学分析用样品存放在4℃，转移到实验室和分析在一小时内3小时。
2.2牛奶和奶油成分分析
下面的分析进行的是所有牛奶和奶油样:酸碱值实验测定了乳酪工厂使用Port mess。911(X)pH计Knick,柏林,德国)连接到一个奶酪 (Hamilton Co., Reno, NV,美国)电极体积混合后,脂肪含量,红外分析(比格斯,1978)的大量样本Milo-Scan 134 a / B(Foss Electric,
DK-3400 Hollered,丹麦)。
2.3微生物的计算和统计分析
首先稀释十倍的样品奶油以260转/分共处2分钟在一个Stomacher实验室搅拌器400 BA
7021(Seward Medical, Worthington,英国),来允许恢复滞留的细菌在脱脂脂肪的小球体集群。样品被稀释在原料液中(0.1%为原料植物真菌为原料。Ovoid, Basingstoke、英国)当必要时包裹在下列媒质中一式两份, 所有器材从Ovoid购买：琼脂板计数(PCA) 培养在30 0 C
48小时的有氧嗜常温的细菌计数,并在7 0 C 7天为有氧嗜冷细菌计数,德曼培养基和尖锐的(MRS)琼脂培养30 0 C为48小时厌氧乳酸菌数(实验室),假单胞菌琼脂基于(PAB)以氟利昂补充培养30 0 C 48小时为假单胞菌计数和紫罗兰红色胆汁葡萄糖琼脂(VRBGA) 培养在37 0
C 24小时为肠杆菌科计数。
克隆体从嗜冷可数PCA板上随机，选择某一天除去三天干乳酪制造每星期(一共有四次除去12天制造级乳酪在四周内)。每个选择的一天,至少10每板和每个样本（全脂牛奶,奶油色和脱脂牛奶)共收集了大约3复制体被隔离在每四天中的一天。复制体被送进PCR中(培养在30 0 C 48小时)和这个过程重复了四次，以获得纯培养。纯化后，菌株传代培养液培养基（磅）介质（蛋白）。革兰氏反应是采用葛瑞格森的氢氧化钾方法（葛瑞格森，1978），过氧化氢酶反应转移克隆体从一个新鲜的琼脂培养基载玻片和加3% hz02，细胞色素氧化酶和氧化酶试验（蛋白）。革兰氏阴性，过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性菌株被镀上葡萄糖琼脂
和培养在37℃时为24 - 48小时，检查其属肠杆菌科家庭；革兰氏阴性，过氧化氢酶阳性，氧化酶阳性菌株被镀上假单胞菌琼脂基础与氟氯化碳补充检查属于假单胞菌属。
细菌菌株保存在-80℃的培养基用20%甘油。
2．4提取和扩增
细菌核酸提取各菌株生长在肉汤隔夜后在30℃。从革兰氏阳性菌提取使用实例矩阵（仪，米兰，意大利）根据制造商的指示，而革兰氏阴性菌核酸提取它的碱性裂解为先前所描述的得到等人。（1987）。
为了减少一些菌株被确定的部分76s基因测序，提取核酸受到随机扩增多态性DNA聚合酶链反应（RAPD）对生物筛选菌株之间的。部分基因测序的基因的不同生物分类鉴定。
扩增反应的最后25 1×2.5毫米氯化镁缓冲区，200wM脱氧核糖核酸三磷酸（核苷酸），每个引物
2wM，0.6 -脱氧核糖核酸酶（生物监测脱氧核糖核酸聚合酶，上海有限公司，伦敦，英国）。三个引物在扩增反应：M 13（5 ' - gagggtggcggttcf-3'；惠和堂，是1989），OPA 3（5 -
agtagcccac-3”），OPA9（5 ' - gggtaacgcc-3'）。阴性对照无菌水更换模板总是包括在无性扩增中。该扩增进行100热循环仪（兆焦耳，水城，马，美国）使用以下协议：40周期由变性94℃1分钟，引物退火45℃为20，在72℃和延长120秒完成所有的合成，程序结论延长72℃10 min，产物进行电泳分离2.5%（重量/卷）琼脂糖凝胶（公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）和可视化的紫外透染色后溴化（0.5克/毫升）。脱氧核糖核酸梯子类（公司）被用来作为一种分子尺寸标记。
2.5遗传模式分析和鉴定菌株的基因测序
在随机分布进行了分析与模式分析软件包胶比较版本4.1（应用数学，科特赖克，比利时）。带状简介计算相似性是基于皮尔森积矩相关系数。聚类的手段获得的加权配对组算术平均法聚类算法。重复性的方法是确定在以往的工作吉野等人。（2008）。歧视功率的分型技术是评价计算，辛普森的歧视指数（猎人和加斯东，1988）。
每一个生物型鉴定的部分基因基因测序的2一3区16 S RDNA正如先前所描述的弗兰乔西等人。（2009）。序列同源率为97%或更大的被认为是属于同一物种（1起等。，1997）。
2.6生长，酸化处理的活动和生产的胞外酶
温度生长测验是由每个孤立体系进入PCA板，分别培养在10，20，30和37℃。增长被认为是正面的，如果菌落直径大于1毫米后三天，除试验在10℃，克隆体七天后被观察。
酶的生产检测采用琼脂扩散试验，根据类型的酶的活性检测。生产的胞外蛋白水解酶和酸化活性检测方法，辅以1%脱脂奶粉（哈伯等人。，1978）和0.174克/溴甲酚紫
（西格玛奥德里奇，圣路易斯，密苏里，美国）。板培养30，20,15℃72小时和10℃的7天，存在明显的区周围的殖民地被认为是表明蛋白质；存在黄色周围地区的殖民地被认为是表明酸化。
琼脂（蛋白），含有0.5%（重量/体积）蛋白胨；0.3%（瓦特/五）酵母提取物；0.1%（体积比）甘油酯，是用于测试的存在外脂肪酶（酯酶）。该板培养在30℃时为72小时；存在明显的区周围的殖民地被认为是表明活动。
生产的胞外磷脂酶（卵磷脂酵素）是评价镇痛补充10%蛋卵黄乳剂（蛋白），所描述的根
和布尔（2003）。生产不透明环周围的卵磷脂，阳性菌落，记录后72小时的潜伏期在30℃。2.7统计分析
单向方差分析（方差分析）进行了可行的数目不同的微生物群体对数变换后的数据通过数据分析软件系统统计软件公司统计
（数据分析软件系统，8版）。
3
结果与讨论
3.1微生物和隔离
样品在12天2008年五月奶酪约1000升的牛奶是要求每个基粒特伦蒂诺奶酪的制作，其中2干酪（40公斤左右各一个）被获得。大约一半的牛奶交付的奶酪厂在晚上和保持在15 - 17℃过夜略读。平均产奶量在晚上是487.8（t20.6）L。成熟后，奶油删减38.5（t2.7），占7.9%的初始量，而部分脱脂牛奶450.4（士19.4）L（91.1%）。散装牛奶和奶油样本立即储存在液态氮在奶牛场。这种做法可能导致减少的板计数如以前显示阅读等。（1969）。表1报告微生物计数的wm送到乳品长在傍晚前脱脂后PH 值，脂肪含量和数量的报告。
表1
根据方差分析总嗜温细菌和其计数没有显着不同于WM和SM样品（平均计数值介于4.4和4.91og个/毫升）。同一项相当高，在那里他们达到浓度高于7日志祖每毫升细菌总数计数，WM和SM是7.1，4.9和4.3分别。这些结果是根据报告的penury等人。（2007）为帕马森乳酪和弗兰乔西等人。（2010）为基粒特伦蒂诺在不同的奶牛在同一省。全冷细菌明显降低（大约1日志，<0.05根据方差）比总细菌数在WM（3.9和4.9日志单位/毫升分别）但不显着的（6.7和7.1日志祖细胞/毫升，分别）和SM（4.3和4.41og祖细胞/毫升，分别）。耐冷菌计数，西医和钐均高于显示的penury等人。（2007）和弗兰乔西等人。（2010）。这种差异的耐冷菌的数量可以是由于细菌污染的农场超过在乳品，事实上冷数在牛奶等乳制品采用相同技术的牛奶交付和位于同一地区（弗兰乔西等人。，2010）更类似于penury的。基于抗体和葡萄糖琼脂
计数在整个晚上牛奶相似（3.9和3.6日志祖细胞/毫升，分别）和减少SM（明显减少了染色计数）。相比之下，这些数量增加，奶油分别高达5.2和4.8单位/毫升。
PH值为6.7，并没有显着改变在奶油中。一半以上的脂肪最初在牛奶（3.66%）通过奶油被去除。考虑到平均量碳（7.9%）和部分钐（92.1%）和微生物计数，总人数的细菌细胞
在每一部分后，先计算：总计数每个微生物群可以被称为总物料量（部分脱脂牛奶加奶油）运用公式：
在提取前体积log 单位/毫升（整个原料乳）=
log 单位/毫升提取后体积
==log（个/毫升奶油×0.079+单位/毫升，部分脱脂牛奶×0.921）。
这是被允许的计算实际增加微生物细胞数与全脂牛奶静止前比较。细胞浓度计算的总数量是6.01og菌落形成单位/毫升（+1.11og菌落形成单位/毫升与全脂牛奶）总嗜温菌，6.4日志祖/毫升（+1.51og菌落形成单位/毫升）为认乙，5.6（+1.71og菌落形成单位/毫升）的嗜冷菌，4.1菌落形成单位/毫升（+0.21og菌落形成单位/毫升）为假单胞菌。和4.01og菌落形成单位/毫升（+0.41og菌落形成单位/毫升）的肠杆菌科。经过一夜的发酵，细菌细胞主要集中在奶油中。
微生物的发展发生在休息的牛奶生产粒特伦蒂诺是根据penury等人。（2007）的全名为：他建议有一个去除细菌培养与脂肪球和增长取决于环境条件和季节。
然而它是很难分开的聚集效应的微生物细胞的牛奶脂肪滴的相乘效果在奶油的环境。可能影响是负责高总计数大量奶油。然而，在15℃时，根据马和芭芭拉（2000）的研究，一个重要组成部分提取涉及较大的脂肪球发生在第一个小时，表明二可能性（生长在奶油中）中起着重要的作用。复制体于板中用于全冷计数随机挑选和纯化，为进一步分析。共138个菌株获得，50从整个晚上前奶膏，45和43部分SM。其中24株，革兰阳性，过氧化氢酶阴性，氧化酶阴性，所有球菌的形
。其余114个革兰氏阴性株过氧化氢酶阳性，其中15例和42cocci-shaped氧化酶阳性。
3.2 RAPD技术特征和生物鉴定
平均重复性的RAPD方法估计为93.9%（最低83.6%，最高98.2%），与分辨率0.98（猎人和加斯东，1988），允许输入所有的菌株（100%类型能力）。三条引物用于遗传分子分型的菌株可以优化洞察应变关联，由于其高的辨识力。本议定书允许分类138个菌株在70种不同的生物型，分布在13个不同的集群在相似水平至少40%；只有四株仍然丛集（图左）。当带模式有一定程度的相似性高于83.6%（最低值重复性）的菌株被视为一个单一型。
70种不同的生物特征和确定，部分基因基因测序。
表2显示所有的生物数量和来源的菌株，鉴定（与比例的身份）和相应的加入号码。最大的集群（簇四，七，十和十三）50%余载的嗜冷生物。生物型组第四和第七属和肠杆菌科被确定为肠杆菌属。（第四组），弗氏柠檬酸和蜂房（簇青）；的生物集群十三被确定为金黄藻（黄杆菌科）而生物集群×属于莫拉氏菌科
和被确定为不动杆菌。鲍曼不动杆菌是最常见的孤立的物种和似乎也在集群，第八和第九，而一个生物型丛集。假单胞菌中发现集群升（假单胞菌），Ⅲ（P加乡和体育丁香）和一个生物型的恶臭丛集。一株黄杆菌也被取消，以及一个生物型单胞菌中发现在奶膏之前。24推定实验室生物属于所有链球菌科和分簇1（6属乳明串珠菌和4乳酸乳球菌），五（4parauberis链球菌），链球菌科生物发现只有在样品。所有其他的集群组成的生物从不同的样品。冷菌株WM ，和SM样本属于假单胞菌，肠杆菌和链球菌科，莫拉菌科
的百分比报告在图2（孤立的单一属气单胞菌科
没有考虑）。这些种群常常是孤立于牛奶和奶制品中（表妹，1982；坚等人。，2004；拉法基等人。，2004；莫桑等人。，2006；阿库里等人。，2008），然而有趣的行为可以证明。
冷假单胞菌科的一个重要组成部分奶油微生物人口（约33%株来源于此）。没有菌株属于假单胞菌。其中从嗜冷菌可以由于其低浓度（约2日志单位低于耐冷菌计数），使他们不可能孤立统计学。
肠杆菌是最常见的孤立于大量种群的种群（大约50%）；这个种群的成员被分离，即使在SM（略低于30%）的条件下但从未从样品里通过。嗜冷菌分离牛奶和奶油粒特伦蒂诺用于生产属于物种柠檬酸加入蜂蜜，不知道是致病性（olives和kippered，1982）。哈夫尼菌是一种最常见的孤立的物种在这些环境中（tornado等人。，2001：马丁斯等人。，2006；kaki等人。，2007；recoiling等人。，2009）。这种微生物群技术的兴趣，因为有些冷肠杆菌物种可以产生蛋白和脂解酶，产生负面影响的感官特征奶酪（山度士张佩华，1996。）。
冷链球菌科很少从SM和C样品中孤立，其中他们分别为9%和7%，然而而他们是主导（38%株）在SM制作奶酪之前。这可能有一个技术性因为牛奶奶酪粒特伦蒂诺没有受到任何热处理和热条件适用在豆腐烹饪可不是致命的这些实验室（豆腐煮到55℃约十分钟），他们可能有助于，在某种程度上，对生化过程的奶酪成熟进行了约18℃。
孤立于食品乳球菌属和明串珠菌属生长在10℃已被报告（recoiling等人。，2009；马塔莫罗斯等人。，2009）。一些实验室的特点提出了生物保鲜食品（罗杰斯，2001）。的能力，乳球菌生长在7℃和较低温度下已报告的knives等人。（2005）。
约27%的菌株WM被黄杆菌科，也被发现在类似的浓度（24%）但从未分离钐。10型黄杆菌科
被确定为金黄杆菌。（表2）。物种的属金黄杆菌是常见污染物的食品（扎哈罗夫和夫人，2007）。金黄也可能发生在牛奶（扎哈罗夫和夫人，2007；Gianni no等人。，2008）。新的物种的chryseo6acterium最近被孤立和特点从原奶（雨果等人。，2003）。
高频率分离的不动杆菌（莫拉菌科）中WM结合较低（19%）比SM（33%），低于样品，在不动杆菌属是最常见的孤立（40%）。连同假单胞菌。，这是最常见的属分离从土耳其原奶（auras和 intake，1998），并且，根据阿库里等人（2008），是一个主要组成部分的微生物的冷藏原料奶。
不同的物种分布在牛奶和奶油样中，也被建议在以往的工作在不同的基粒特伦蒂诺奶酪厂（弗兰乔西等人，2070），对分布在牛奶和奶油不同的物种样本进行了分析，利用变性梯度凝胶电泳（法）。实验室物种被发现在所有的奶油和牛奶样品；肠杆菌物种被发现牛奶中但不是在所有奶油中。
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