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BEIJING DAILY CHEMICAL2016年6月 第3期
总第124期1991. 1073(1): 85-90. [8]Kazuhisa maeda,minorufukuda, MINORU
n: Mechanism of Its Depigmenting
Action in Human Melanocyte Culture. The journal
of pharmacology and experimental therapeutics.1996.2(276):765-769. [9].Cabanes J, Chazarra S, Garcia-Carmona
acid, a cosmetic skinwhitening agent, is a slow-binding
inhibitorof catecholase activity of tyrosinase. .
Pharmacol., 1994. 12(46): 982–985.[10].Parvez S, Kang M, Chung HS, and
Mechanism of Skin Depigmenting and Lightening
Agents. Phytother. Res, 2006. 20: 921–934.[11].Ando H, Wen ZM, Kim HY, et al. Intracellular
composition
of fatty acid affects the processing and function
of tyrosinase through the ubiquitin–proteasome pathway.
Biochemical Journal, 2006. 394(1): 43-50.[12].Ando H, Watabe H, Valencia JC, et al. Fatty Acids Regulate
Pigmentation via Proteasomal Degradation of Tyrosinase: A
NEW ASPECT OF UBIQUITIN-PROTEASOME FUNCTION.
Journal of Biological Chemistry, 2004. 279(15): 15427-15433.[13].Balcos MC, Kim SY, Jeong HS, et al. Down-regulation of
Melanogenesis by Phospholipase D2 through Ubiquitin
Proteasome-mediated Degradation of Tyrosinase.
Journal of Biological Chemistry, 2004. 279(26): 27774-27780.[14].Virador VM, Muller J, Wu nce of
a-melanocyte-stimulating hormone and of ultraviolet
radiation on the transfer of melanosomes to
keratinocytes. The FASEB Journal, 2001.16(1):105-107[15].Seiberg M, Paine C, tion of
Melanosome Transfer Results in Skin Lightening.J Invest
Dermatol.2000,115:162-167[16].Scott G, Leopardi S, Parker L,et Proteinase-Activated Receptor-2 Mediates Phagocytosis in a Rho-Dependent Manner in Human Keratinocytes.J Invest
Dermatol 2003,121:529-541[17].Hakozaki T, Minwalla L, Zhuang J,et effect
of niacinamide on reducing cutaneous pigmentation
and suppression of melanosome h Journal
of Dermatology 2002 ,147(1):20-31[18].Kim B, Lee SH, Choi KY, et al.N-nicotinoyltyramine,
a novel niacinamide derivative, inhibits melanogenesis
by suppressing MITF gene expression. European Journal
of Pharmacology, 2015. 764: 1-8.[19].Lee WJ, Rhee do Y, Bang SH,et natural
yeast extract isolated by ethanol precipitation
inhibits melanin synthesis by modulating tyrosinase
activity and downregulatingmelanosome transfer.
BiosciBiotechnolBiochem, 2015. 79(9): 1504-11.[20].Denda S, Denda M, Inoue K ,et ic acid
induces keratinocyte proliferation in a skin equivalent
model via TRPV1 activation. Journal of Dermatological
Science, 2010. 57(2): 108-113.光老化皮肤的体外生物学检测车景敏、李潇陕西博溪生物科技有限公司摘要：皮肤老化分为内源性老化和外源性老化。外源性老化主要发生于皮肤的暴露区，是由外界压力（UV，雾霾等）对皮肤的长期刺激引起的皮肤的老化。这些刺激物对皮肤的危害以UV辐照最为显著，这一现象也被称为光老化。光老化过程中可导致皮肤细胞以及细胞间的联系发生很大的变化。比如，DNA的损伤，细胞抗氧化能力的失衡，基质金属蛋白酶的升高，胶原含量的降低，弹性纤维的变形以及表观的显著变化（皱纹，皮肤松弛）等。此外，在皮肤光老化过程中，角质层也会发生显著的变化，主要表现为抗氧化物的降低以及过氧化物的积累。本文主要结合皮肤光老化过程，针对可应用于体外光老化评价的角质层指标及检测方法进行论述。关键词：光老化，蛋白羰基化，MDA，VE，体外检测皮肤的老化分为自然衰老和外源性衰老。外源性衰老或皮肤光老化是皮肤长时间受到外界刺激，尤其是UV辐照导致的皮肤真皮层以及表皮层的皮肤衰老，此现象在高加索人群中表现尤为明显[1]。光老化与自然性衰老不同，自然性衰老对皮肤造成的后果主要有皮肤松弛、细纹的产生以及良性肿瘤，而光老化带来的后果有加深皱纹、色斑、肤色不佳、癌变等多项问题。紫外线作为光老化的主要诱因，导致皮肤细胞DNA的损伤，免疫调节能力的下降以及结缔组织结构的改变[2]，进而导致皮肤皱纹，色斑，弹性的一系列变化。光老化的过程伴随着皮肤细胞多项指标的变化，比如蛋白羰基化产物的增加，角质层MDA含量的增加，角质细胞健康度的降低，以及皮肤表皮细胞VE分泌的减少以及抗氧化物酶的变化等。这些皮肤生理学指标的变化可以通过无创性皮肤胶贴采样，结合体外检测方法（Cutaneous Biological Test，CBT ）进行分析，实现对皮肤抗光老化的能力，以及化妆品原料、产品的抗光老化功效进行科学评价。蛋白羰基化的体外评价蛋白羰基化是羰基化合物对蛋白质的修饰过程[3,4]。主要包括两种类型：（1）蛋白质与羰基化合物（醛类化合物以及脂质过氧化物）反应产生的羰基化蛋白产物；（2）蛋白质自身被氧化（自身ROS）产生的羰基化蛋白产物。皮肤蛋白羰基化产物的形成主要集中在皮肤的角质层以及真皮的上层。蛋白羰基化的积累可以导致皮肤角质层
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6透明度的下降，保水能力的不足，并且会导致真皮层弹性纤维以及胶原蛋白的变性[6]。此外，也有研究表明，真皮层蛋白羰基化产物的积累会导致皮肤颜色的变黄[5]。我们的研究发现，曝光区皮肤的蛋白羰基化水平显著高于非曝光区（图1）。此外，雾霾等环境压力暴露皮肤，也会显著提高皮肤的蛋白羰基化水平（图2）。前者说明了UV刺激促进了皮肤细胞ROS的产生，导致皮肤细胞中的蛋白的自身氧化产生蛋白羰基化产物；后者说明了烟熏产生的醛类以及导致皮肤脂质的过氧化物，加速皮肤细胞中的蛋白羰基化产物的形成。联系。0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.530.0min图3. 经过UVB辐照后角质形成细胞中MDA的含量检测（A：对照组；B：UVB辐照组）角质层VE的体外评价VE是存在于皮肤中的一种脂质抗氧化物，是公认的抗氧化剂。VE主要有四种类型（α-，β-，γ-，δ-），其中α-VE的抗氧化能力最高[7]。VE对皮肤具有光保护的作用，可以有效地减少光损伤的细胞[8]、减少UVB辐照的伤害[9]。VE可以明显抑制皮肤脂质过氧化物的反应、清除自由基，有效的减少过氧化物的生成，进一步维持了细胞膜的正常功能；VE还参与了线粒体的呼吸，以及细胞色素的形成过程，对提高机体的免疫以及抗衰功能都有促进作用[10]。在光老化过程中，皮肤最外层的VE是最先感受到皮肤刺激的抗氧化物质。有研究表明[11]，随着光老化程度的增加，VE的含量会显著降低，并且皮肤角质层中的MDA水平会随之升高。图1. 皮肤曝光区与非曝光区蛋白羰基化水平的对比
图2. 皮肤未经烟熏部位与烟熏部位蛋白羰基化水平的对比备注：利用胶贴分别进行非曝光区和曝光区的皮肤采样，FTZ荧光染料染色并在荧光显微镜下观察。抗氧化物酶的体外评价皮肤中含有多种抗氧化物酶，但在皮肤光老化过程中起到关键的抗氧化物酶[12]主要有超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（Catalase）和谷胱甘肽（GSH）。在皮肤受到UV慢性损伤或是ROS侵害时，SOD可以催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，平衡皮肤细胞中的氧自由基，对过氧离子产生的毒性以及延缓衰老有一定的防御作用[13]。Catalase蛋白可以和H2O2共存于颗粒层的细胞质中，但是当角质层中有H2O2积累时，Catalase就会被激活，可以中和H2O2氧化压力造成的皮肤的损伤[14]。皮肤中过氧化物酶的存在主要是抵御ROS对皮肤的伤害作用，而这些酶会随着年龄和外界环境的刺激（UV辐射，雾霾）而减少，尤其在光老化过程中。研究结果表明，抗氧化物酶的含量会随着光老化皮肤的严重程度增加而减少。抗氧化酶在皮肤中的含量直接影响皮肤自身的抗衰老能力。通过胶贴采样，对个体皮肤可以进行抗氧化物酶活力的体外评估。这种方法能简单，快速，准确地判断皮肤的抗衰老能力。MDA的体外评价丙二醛（MDA）是脂质过氧化物的一种。MDA的产生主要是因为皮肤受到UV辐射加快了皮肤细胞内自由基的形成速率，而自由基具有极强的氧化能力，可以氧化生物膜上的不饱和脂质产生脂质过氧化物。MDA作为脂质过氧化物的终端产物，具有很强的交联特性。MDA在细胞中可以和蛋白、核酸以及脂质形成不溶性物质，进而导致了皮肤的一系列氧化损伤[6]。皮肤细胞中的MDA可在活细胞及角质层细胞中检出。我们的研究发现，细胞水平检测的MDA的含量，UVB辐照组与未辐照组具有明显的差异（图3）。在人体皮肤表面，通过胶贴采样，HPLC检测不同人群的角质层细胞中MDA的含量结果显示，MDA的含量变化与皮肤暴露时间及衰老程度有密切数数数数数:数数数A 310nm
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总第124期皮肤老化是一种持续渐进性的生理过程，直接影响皮肤的外观与功能，因此抗衰老化妆品成了广大消费者热衷的产品方向，而抗衰化妆品的安全性和功效性评价更是产品开发与消费者关注的焦点。目前对于抗衰化妆品的功能评价主要集中在临床评价以及仪器检测。临床评价以及仪器检测法虽然直接，但是具有一定的主观性，受志愿者个体因素以及测试环境因素影响较多。因此，结合皮肤光老化的一些生物学变化，明确具体发生机理的前提下，通过皮肤胶贴采样，进行相关指标体外检测和表征，既可以对临床功效评估方法体系进行补充，实现检测结果的客观性、科学性和高通量，又可以获取对产品功效的基础数据支持，对企业寻找新的产品功效宣称点具有重要的支持意义。—— 证明皮肤美白产品有效性或及美2015.9食品医药品安全评价院功能性化妆品有效性评价指南白功能的资料参考文献[1] G.J. Fisher, The pathophysiology of photoaging of
the skin, Cutis 75 (2005) 5–8.[2] F. Parhami, Possible role of oxidized lipids in osteoporosis:
could hyperlipidemia be a risk factor, ProstagLeukotr. Essent.
Fatty Acids 68 (2003) 373–378[3] ion-catalyzed oxidation of
proteins：biochemical mechanism and biological
consequences〔J〕.Free RadicBiol Med，1990(9)：315-25.[4] n oxidation and aging〔J〕.Free
Radic Res，2006；40:1250-8.[5] Yuki Ogura, Tomohiro Kuwahara, Minoru Akiyama,
TetsujiHirao, et al., Dermal carbonyl modification
is related to the yellowish color change of photo-aged Japanese facial skin. Journal of Dermatological
Science, 2011, 64: 45-52.[6] 陈芙莉，杨文敬，朱建莹．全身麻醉下射频治疗全面部皮肤松弛老化69 例临床观察[J]．中国美容整形外科杂志.
2013, 24( 2): 88－89．[7] Nachbar F, Korting HC. The role of vitamin E in
normal and damaged skin. J Mol Med 1995,73(1):7-17.[8] Darr D, Combs S, Dunston S, et al. Topical vitamin C
protects porcine skin from ultraviolet radiation-induced
damage. Br J Dermatol 1992,127(3):247-53.[9] Trevithick JR, Xiong H, Lee S, et al. Topical tocopherol
acetate reduces post-UVB, sunburn-associated
erythema, edema, and skin sensitivity in hairless mice.
Arch BiochemBiophys 1992,296(2):575-82.[10] 王红丽，吴铁，吴志华，等．丹参酮和维生素E抗皮肤衰老作用的比较研究［J]．中国老年学杂志, 2003, 12( 23):
861－862.[11] Jen J, Thiele, Maret G, Traber, Lester Packer.
Depletion of Human Stratum Corneum Vitamin E: An
Early and sensitive in vivo marker of UV induced photo-oxidation. Journal of investigative dermatology, 1998, 5(110): 756-761.[12] Y. Shindo, E. Wit, D. Han, Enzymic and non-enzymic
antioxidants in epidermis and dermis of human skin, J. Invest.
Dermatol. 102 (1994) 122–124.[13] Huang JZ, LemireBD . Mutations intheCelegans
succinatedehydro -genase iron-sulfur subunit promotesuperoxidegenerationandprematureaging.[J] JMolBiol, 2009; 387: 559-69.本指南是针对【功能性化妆品审查规定】（食品医药品安全处 2015-15号通知，2015.3.25修订）里规定的功能性化妆品有效性评价方法及功能性化妆品审查资料等进行说明，对外不具有法律效力，以迄今为止的实际经验及科学事实为根据，如有新的科学依据或相关规定有所修改，则本指南将会根据具体情况有所变动。※指南记述的是食品医药品安全处对于某些对外的问题的立场。（食品医药品安全处指南等关于管理的规定_食药处例规）※如对本指南有疑问，可以通过以下方式联系我们。食品医药品安全评价院生物生药审查部 化妆品审查科 T.043-719-3602 F.043-719-3600功能性化妆品的有效性评价指南制定/修订序号B1-2003-4-001B1-2015-4-004通过日期主要内容2003.11.功能性化妆品的有效性评价指南（制定）2015.9功能性化妆品的有效性评价指南（修订）目录概要测试方法· A. 功效测试· In vitro tyrosinase抑制酪氨酸酶活性测试· In vitro DOPA抑制氧化反应测试· 抑制黑色素合成测试· B. 人体临床测试· 人工色素沉淀后，美白效果评价测试
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