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HPLC测定人血浆中紫杉醇浓度

中国色谱网(2010-7-20 14:12:04)

摘要

目的：建立人血浆中紫杉醇HPLC测定法，

为人体内药代动力学研究和药效学评价提供方

法学基础。

方法：取血浆300μl，以地西泮为内标，

采用有机相(叔丁基甲醚)两步提取。常温下氮

气吹干，残渣用移动相溶解，进样20μl。色谱

条 件：Shim-PackCLC-ODS柱；流动相：甲醇-

乙腈-水(25∶40∶39)；流速为1.2ml*min-1，

检测波长227nm。

结果：本法在0.03～5.00mg*L-1间线性良

好，相关系数r=0.9999(n=7)。高中低浓度的3

个质控样品日间内变异性RSD都在2.31%～

4.90%之间，回收率在97.4%～103.3%之间，血

浆最低检测浓度为0.008mg*L-1。

结论：本方法能简便、准确地测出血浆中

微量药物的含量，适于研究需要。

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紫杉醇被誉为90年代抗肿瘤药三大成就之

一，对铂耐药的卵巢癌疗效较好，作为应用于

临床的新型药物，它既是妇科卵巢癌、乳腺癌

和非小细胞肺癌的 一线用药，也是肿瘤晚期仍

行之有效的化疗药物，临床上对其给药方案和

剂量确定有许多不同的观点，仍需借助药-时数

据进行客观的评价。低浓度紫杉醇测定一直 是

困扰研究的大问题。国外文献报道的固相提取

和预柱分离过程需要较高的成本，技术要求复

杂，因而限制了对紫杉醇的研究。我们建立了

测定人血浆中紫杉醇的 HPLC法，取样量小，灵

敏度高，快速简便。为确定合理的治疗方案和

治疗剂量，以及药代动力学分析和药效学评价

提供了方法学基础。

1、材料与方法

1.1 仪器与色谱条件

美国Warters-M510泵和U6K进样阀；日本

岛津SPD-2AS型可变波长紫外检测器和C-R2AX

数据处理 机；100μlHamilton进样器(美国)；

液体混合器(UpwardsBiosystemsLtd.，台湾)；

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LG15-W高速微量离心混合器(上 海)；

PING-PONG卧式振荡器(BlockScientific，德

国)；Milipore超纯水系统(法国)。

Shim-PackCLC-ODS 柱(6.0mm×150mm)，流动

相：甲醇-乙腈-水(25∶40∶39)，流速为

-1，检测波长为227nm，纸速

-1，室温下操作，检测灵敏度

0.0005AUFS。

1.2 药品与试剂

紫杉醇对照品(中国医学科学院药物研究

所)；地西泮对照品(北京市药品检验所)；叔丁

基甲醚(瑞士FlukaChemicAG)，甲醇和乙腈(北

京昌化精细化工厂，色谱纯)；水为实验用超纯

水。

1.3 储备液

紫杉醇标准品适量制成200mg.L-1的溶液

(甲醇-水=4∶1)，4～10℃储存备用，每4周配

一次。地西泮水溶液(1.2mg.L-1)作为内标。

1.4 样品处理

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1.4.1 血浆样本精密吸取待测血浆300μl

置于1.5ml具塞塑料离心试管中，先后加入

20μl1.2mg.L-1内标和1ml叔丁基甲醚，于卧

式振荡器上混合 3min后，3000×g离心3min，

将800μl上清液移至另一1.5ml的具塞塑料试

管中。用800μl叔丁基甲醚，重复上述操作合

并上清液，氮气 吹干，溶于120μl流动相中，

吸取20μl进样。

1.4.2 标准曲线的制备用空白血浆分别配

制浓度为0.03，0.10，0.50，1.00，2.00，3.00，

5.00mg.L-1的紫杉醇血浆标准系列。其余操作

同血浆样本处理过程。以紫杉醇浓度c为横坐

标，紫杉醇峰高与内标峰高之比为纵坐标绘制

标准曲线。

1.4.3 质控样品以配血浆标准样品同样方

法，另行配制紫杉醇的质控样品，浓度分别为

0.25，2.50，4.00mg.L-1。它们将作为“未知

样品”随机分散于 每批待测血样和血浆标准

样品进行测定，以每次的标准曲线计算出质控

样品测定浓度。以质控样品测定浓度与标示浓

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度的比值计算方法的精密度、重现性和回收率。

2、结果

2.1 色谱行为

紫杉醇在227nm处显示最大吸收。选用

227nm作为检测波长时，所用色谱条件下基线波

动小，紫杉醇和内标峰形尖锐。空白血浆层析

图谱中对应紫杉醇和内标的保留时间12.2min

和9.7min处无峰出现，与各杂质峰分离良好。

2.2 线性关系和灵敏度

血浆中紫杉醇浓度在0.03～5.00mg.L-1范

围内，r=0.9999(n=7。检测器灵敏度为

0.0005AUFS，以基线噪音3倍计算，最低检测

浓度为0.008mg.L-1。

2.3 精密度和重现性

制作血浆标准曲线，按血样项下操作，测

定质控样品浓度，考察批内和批间变异。分试

管制作同浓度样品，测定批内误差，日内变异

性，结果见表1。一批同浓度样品系列分散在2

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周内同上制作，测定批间误差，日间变异性。

2.4 方法回收率

高、中、低3个浓度的质控样品按未知样

本随标准曲线同时测定，计算出质控样品的批

内，批间和回收率数据。不论方法质控，还是

每次的样品测定，均附带一套标准曲线和质控

样品数据。

2.5 干扰试验

我们对地塞米松、西咪替丁、苯海拉明等

临床与紫杉醇合用的辅助药物进行了考察，结

果表明，这些药物在紫杉醇和地西泮的保留时

间处均无峰出现。

3、讨论

3.1 在相对较低的UV波长测定时一般要求

生物样品提取尽可能完全和干净。因此文献多

采用固相提取和预柱分离，操作手段繁杂，技

术要求高。通过试验表明，叔丁基 甲醚是紫杉

醇良好的提取剂。在样本的提取过程中，采用

适当体积的有机相两次提取浓缩方式，令紫杉

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醇富集，标准曲线的浓度可低至0.03mg*L-1，

且紫 杉醇和内标出峰处无杂峰干扰。我们采用

的这种提取的方法操作简便，不需要配置固相

分离柱，能较好适应目前大多数实验室条件，

同时也保证了检测灵敏度。

3.2 目前国外文献所用内标大多采用

cephalomanmine，N-cyclohexyl-benzamine，2，

-benzyl-2，2- dimethyl-propionanilide3种，

多为厂家直接提供，价格昂贵。在色谱条件下，

还要通过梯度洗脱，才能与紫杉醇之间产生一

合适的分 离。经过多次尝试，发现地西泮作为

内标，在本流动相下，峰型尖锐，与紫杉醇分

离良好，出峰时间较短，工作效率提高。且此

药物价格便宜，易于获得，有利于国 内研究单

位开展工作。此外文献方法所用血浆多在0.5ml

左右，这样临床采血量将相应增加。本方法以

较少血浆就能满足测定需要，最大限度地减少

病人痛苦。

信息来源：中国色谱技术网

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