2024年4月10日发(作者：)

生物软件应用论文

引物设计软件Premier Primer 5

姓名 宋瑞雪 __

学号 2

引物设计软件Premier Primer 5

生物信息处理班 宋瑞雪 2

PCR引物设计引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能

有效地扩增模板DNA序列。

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA

单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段

DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则：

1、引物Tm：引物所对应模板序列的Tm 值最好72℃左右。至少要在55

－80℃之间。Tm=2(A+T)+4(C+G)。

2、引物长度：大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产

物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18)的引物；若产物长5 kb，则用24

个核苷酸的引物。有人用20～23个核苷酸引物得到40 kb的产物。

3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过

多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸

的成串排列。

4、ΔG(自由能)值：ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度。引物的Δ

G值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较

低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反

应而可防止错误引发。

5、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠,引物内

部不应出现互补序列。

6、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8

个碱基在待扩增以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

7、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最

佳选择是G和C。

8、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、

荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

引物应具有特异性

引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就

可以进行下一步的实验了。

以具有解暑止渴、消食止泻之功，为夏令医食兼优的时令佳果的菠萝为例，

选取具有OPAE 14标记，长度为1005bp的基因组序列：