2024年6月14日发(作者：)
ChinaAnimalHusbandreterinaredicine
y
&V
y
M
():
中国畜牧兽医
2024
,
513893-902
/
基于
CRISPRCas9
技术构建猪
KLF
4
基因
敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析
(
扬州大学动物科学与技术学院
,
扬州
2
江苏省农业科学院农产品质量安全与
1.25009
;
2.
)
营养研究所
,
南京
2
昆山市畜禽屠宰检疫中心
,
昆山
210014
;
3.15300
/()
摘
要
:【
目的
】
试验旨在利用
C
基因敲除的
RISPRCas9
技术构建
Krüel
样因子
4Krüel-likefactor4
,
KLF4
pppp
猪小肠上皮细胞
,
并探究
K
方法
】
在猪
KLF
4
基因敲除对于细胞活性和细胞周期的影响
。【
LF
4
基因转录本第
1
外
(,
显子区域设计
3
条
s
经退火形成的双链
DRNAssRNA1
、
sRNA2
和
sRNA3
)
NA
与线性化
p
GK1.1
载体连
gggg
TM
除位点附近序列
,
并通过测序判断
s
利用
C
通过
TA
克
RNA
敲除效率
;
ruiserEnzme
酶切鉴定阳性细胞克隆
,
gy
董
娇
1
,
陆
繁
1
,
方晓敏
2
,
陈瑜哲
3
,
包文斌
1
,
王海飞
1
)。
P
接
,
产物转化大肠杆菌
T
并将重组载体转染至猪小肠上皮细胞
(
o10
感受态细胞进行鉴定
,
IPEC-J2CR
扩增敲
p
隆测序鉴定敲除序列
;
利用
WesternblottinLF4
蛋白表达情况
。
利用
CCK-8
和流式细胞
g
检测基因敲除细胞中
K
术检测
KL
结果
】
重组载体测序结果显示
,
F
4
基因敲除后细胞活性和细胞周期的变化
。【
sRNAs
与
p
GK1.1
成功
g
TM
CruiserEnzme
酶切筛选出
2
个阳性单克隆细胞
。
TA
克隆测序分析发现
,
KLF
4
基因
2
个等位基因序列分别缺
y
连接
。
分析敲除效率发现
,
其中
s3
个
sRNAs
均可对靶序列进行敲除
,
RNA3
有较高的敲除效率
。
PCR
产物经
gg
。
W
失
116
和
137besternblottin
KLF
4
基因敲除细胞中未见
KLF4
蛋白表达
。
细胞活性及细胞周期
pg
结果表明
,
,/
分析显示
,
敲除
K
并导致
G
结论
】
本研究利用
LF
4
基因极显著抑制了细胞活性
(
P
<0.01
)
0S
细胞周期阻滞
。【
胞周期阻滞
。
KLF
4
基因敲除细胞可为进一步探究
KLF
4
基因功能及分子机制提供材料
。
/
关键词
:
猪
;
细胞活性
;
细胞周期
KLF
4
基因
;
CRISPRCas9
技术
;
中图分类号
:
S852.2
文献标识码
:
A
//
且
KL
并引起
GCRISPRCas9
技术构建了
KLF
4
基因敲除的
IPEC-J2
细胞
,
F
4
基因敲除可抑制细胞活性
,
0S
细
:
1
/
:
资源服务
)
标识码
(
Doi
.1671-7236.2024.03.001
开放科学
(
OSID
)
j
ConstructionofPorcine
KLF
4GeneKnockoutCellUsin
g
/
CRISPRCas9TechnolondItsEffectonCellViabilit
gy
a
y
112311
,
L
,
F
,
CHE
,
B
,
WANGHDONGJiaoUFanANGXiaominNYuzheAOWenbinaifei
(,
1.
ColleeonimalScienceandTechnolo
YanzhouUniversitYanzhou
225009
China
;
gf
A
gy
,
gy
,
g
2.
InstituteooodSaetndNutrition
,
JiansuAcademriculturalSciences
,
f
F
fy
a
gy
o
f
A
g
Nanin
10014
,
China
;
3.
LivestockandPoultrlauhterinndQuarantine
jg
2
y
S
gg
a
Centerounshan
,
Kunshan
215300
,
China
)
f
K
:【】)
Abstract
ObectiveTheaimofthisstudastoknockoutKrüel-likefactor4
(
KLF4ene
jy
w
ppg
/,
in
p
orcinesmallintestinaleithelialcellsusinRISPRCas9techniueandinvestiatethe
pg
C
qg
,
strandedDNAafterannealinasliatedwiththelinearized
p
GK1.1vectorandthe
p
roducts
g
w
g
【】
Teffectsof
KLF
4
g
hree
p
airsofsRNAs
y
a
yg
(
sRNA1
,
sRNA2andsRNA3
)
weredesinedinexon1of
p
orcine
KLF
4
g
ble
gggg
wastransferredinto
Escherichiacoli
ombinant
pp
收稿日期
:
2023-09-06
);)
基金项目
:
江苏省高等学校基础科学研究重大项目
(
扬州大学大学生科技创新基金项目
(
22KJA230002X20220634
::
联系方式
:
董娇
,
E-maildxhrrt@
。
通信作者王海飞
,
E-mailhfiwan@
y
jpyg
894
中
国
畜
牧
兽
医
51
卷
)
vectorsweretransfectedinto
p
orcineintestinaleithelialcells
(
encesadacent
pqj
tothetaretsiteswereamlifiedbCR
,
andtheknockoutefficiencfsRNAwasverifiedb
gpy
P
y
o
gy
TM
,
p
ositivecellcloneswereselectedbruiserEnzmediestionandthe
qgy
C
yg
therecombinantvectorsshowedthatsRNAsweresuccessfullliatedwiththe
p
GK1.1vector.
gyg
,
AnalsisofknockoutefficiencemonstratedthatallthreesRNAscouldleadto
g
eneknockout
yy
d
g
p
ositivecellcloneswereselectedb
ggyy
TM
eseuencinesultsindicatedthat116and137beuences
ygqg
r
p
s
q
,
weredeletedinthetwoallelesof
KLF
4
g
nblottinesultsshowedthat
pyg
r
nesofcellviabilitndcellccle
gy
W
ggy
a
y
【】
of
KLF
4
g
Seuencinf
yy
C
yyqg
o
essionofKLF4
p
roteinin
qy
T
qgp
/
inhibitcellviabilitndresultincellcclearrestatG0Stransition.
KLF
4
g
eneknockoutcells
y
a
y
could
p
rovidethematerialsforfurtherexlorinunctionsandmolecularmechanismsof
KLF
4
pg
f
ene.
g
:;;/;;
Keords
i
KLF
4
g
ene
CRISPRCas9techniuecellviabilitcellccle
pgqyy
y
w
),/【】
sion
KLF
4
g
eneknockoutIPEC-
y
/
J2cellswereconstructedinthisstudsinRISPRCas9techniue.
KLF
4
g
eneknockoutcould
y
u
g
C
q
KLF4
p
roteinwasnotexressedin
KLF
4
g
sofcellviabilitndcell
pyy
a
ccleshowedthat
KLF
4
g
eneknockoutextremelinificantlnhibitedthecellviabilit
P
<
yy
s
gy
i
y
(
,
Krüel
样转录因子
(
Krüel-likefactor
pppp
是一类具有锌指结构的转录因子
,
包括
1KLF
)
7
个
,
家族成员基因
(
其典型结构特征
KLF1~KLF17
)
是在其
C
末端具有
3
个
C-2H2
锌指结构
。
KLF
在
细胞的增殖
、
分化和胚胎发育过程中发挥着重要调
肠道上皮富集
,
所以称之为胃肠富集
KLF
(
ut-
g
[]
1
,。
KenrichedKrüel-likefactorGKLF
)
LF4
包
pp
制结构域
,
其中
DNA
结合结构域位于
KLF4
蛋白
末端
,
含有
3
个锌指结构
,
可通过结合基因启动子
C-
区的
CACCC
元件或
S1
元件来调节其下游基因的
p
]
2
。
K
转录活性
[
LF
4
基因表达受转录及转录后水平
5
]
。
C
/
析等优点
[
RISPRCas9
系统由
CRISPR
基因
作用
。
CRISPR
基因座上对应
DNA
转录得到
引
tracrRNA
,
Casoeron
转录翻译得到
Cas9
蛋白
,
p
导序列加上
C
这
RISPR
序列转录得到
p
re-crRNA
,
三者经过
RNaseⅢ
剪切得到核糖核酸蛋白复合物
保守的核苷酸序列
,
从
5
端到
3
端通常以
NG'-'-G
的
(,
能够对
DCas9
蛋白
+tracrRNA+crRNA
)
NA
双
链产生剪切作用
。
CRISPR
基因座上存在几个非常
座
、
tracrRNA
及
Cas9
核酸内切酶分别发挥不同的
节作用
。
K
又因为在胃
LF4
最初发现于胃肠道中
,
含
3
个结构区域
:
激活结构域
、
抑
DNA
结合结构域
、
,,
在
cadacentmotifPAM
)
rRNA
特异性识别靶序
j
6
]
。
2
列过程中发挥重要作用
[
013
年
,
CRISPR-Cas9
7-8
]
。
作
技术首次实现在细胞及个体水平进行编辑
[
形式存在
,
称之为原型间隔区相邻基序
(
rotosacer
pp
化可抑制
KLF
4
基因的转录活性
;
微小
RNA
(
可在转录后水平负调控
K
microRNA
)
LF
4
基因的
3-4
]
。
K
表达
[
LF
4
基因在不同物种及不同组织中具
多种机制调控
,
启动子
DNA
甲基化和组蛋白甲基为基因功能研究的重要遗传手段
,
研究人员利用该
技术已鉴定出众多调控人类疾病和动物重要经济性
9-10
]
。
状及疾病抗性的功能基因
[
有高度的保守性
,
通过
NCBI
网站
BLAST
功能比
较猪和人的锌指类内含子长度和序列差异发现
,
猪
和人的
K
而氨基酸序列比
LF
4
基因相似性达
82%
;
对表明
,
猪和人
KLF4
相似性达
92%
。
/
CRISPRCas9
系统是来源于细菌和古细菌的
一种天然适应性免疫防御机制
,
近年来广泛应用于
动物基因编辑中
,
具有易设计
、
易操作
、
易控制
、
易分
(/
为研究模型
,
利用
CIPEC-J2
)
RISPRCas9
基因编
辑系统构建
K
并利
LF
4
基因敲除的
IPEC-J2
细胞
,
基因敲除对细胞活性及细胞周期的影响
,
以期为进
挥着重要的调控作用
。
本研究以猪小肠上皮细胞系
综上
,
细胞增殖等过程中发
KLF4
在基因表达
、
用细胞活性测定和流式细胞术等技术分析
KLF
4
一步探究猪
KLF
4
基因的功能和作用机制提供依
据
。
3
期
/
董
娇等
:
基于
CRISPRCas9
技术构建猪
KLF
4
基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析
895
1
材料与方法
1.1
材料
IPEC-J2
细胞由江苏省扬州市生猪产业重点实
验室保存
;
胎牛血清
、
胰蛋白酶
DMEM
培养基
、
毒素质粒小提试剂盒
、
天根生化
DNA
提取试剂盒
(
;
科技
(
北京
)
有限公司
)
氨苄青霉素
、
青霉素链霉素
-
;
股份有限公司
)
细胞周期检测试剂盒
(
碧云天生物
;
(
科技有限公司
)
上海翊圣生物
CellCountinit-8
g
K
;
科技有限公司
)
反转录试剂盒
、
SYBR
荧光定量试
;
剂盒
(
南京诺唯赞生物科技有限公司
)
Trizol
裂解
;
液
(
北京索莱宝科技有限公
Invitroen
公司
)
PBS
(
g
表
1 sRNA
寡聚核苷酸序列
g
Table1 OlionucleotideseuenceofsRNA
gqg
sRNAs
g
sRNA1
g
sRNA2
g
斜体字母表示接头序列
sRNA3
g
;
司
)
鼠抗
K
圣克鲁斯生物技术
(
上海
)
有
LF4
抗体
(
;
限公司
)
山羊抗小鼠
I
抗体
(
康为世纪生
G
(
H+L
)
g
。
物科技股份有限公司
)
1.2
方法
1.2.1
靶位点的选择
根据
GenBank
数据库中
:/)
应用
C
设
RISPRDesin
(
htt∥
gpp
计
s
选取评分排名前三的序列用
RNA
向导序列
,
g
sRNA3
。
正向
sRNA
序列前添加接头序列
gg
反向
s
引物信息
CACC
,
RNA
序列前添加
AAAC
,
g
见表
1
。
于后续试验
,
分别命名为
:
sRNA1
、
sRNA2
和
gg
(
;
Gibco
公司
)
T4DNA
连接酶
、
T7
核酸内切酶
1
、
;
无内
Bbs
Ⅰ
酶
(
NEB
公司
)
DNA
纯化回收试剂盒
、
混合液
、
生工生物工程
(
上海
)
etPRIME
转染试剂
(
j
猪
K
登录号
:
NM
_
LF
4
基因转录本序列
(
),
选定第
1
外显子区域作为打靶区域
,
001031782.2
F
:
CACC
GACGTTATTCGGGGCACCTGC
F
:
CACC
GACAACACTCACGTTATTCG
F
:
CACC
GACAGCCATGTCAGACTCGCC
)
Primerseuences
(
5'→3'
q
引物序列
R
:
AAAC
GCAGGTGCCCCGAATAACGTC
R
:
AAAC
CGAATAACGTGAGTGTTGTC
R
:
AAAC
GGCGAGTCTGACATGGCTGTC
Italiclettersreresenttheadatorseuence
ppq
1.2.2
敲除载体构建
将合成的
sRNA
正反
g
向寡聚核苷酸序列按照如下程序进行退火
,
形成双
链
D
正
、
反向序列各
NA
。
退火反应体系
30
μ
L
:
10
μ
L
,
10×Buffer3
μ
L
,
ddH
2
O7
μ
L
。
95℃
孵育
用移液枪
50
μ
L
感受态细胞并加入
5
μ
L
连接产物
,
;,
轻吹混匀
,
置于冰上孵育
30min42℃
金属浴
90s
,
迅速转移至冰上冷却
5m
加入
1minL
无抗的
LB
/
培养液
,
将菌液均匀
37℃
摇床
200rmin
培养
1h
;
涂布于含卡那霉素抗性的培养平板上
,
37℃
培养箱
倒置培养过夜
,
次日挑取单个白色菌落进行
PCR
鉴
)
为
p
下游引物
TGAAAG-3'GK1.1
载体通用引物
,
。
P
为反向寡核苷酸序列
(
表
1
)
CR
反应体系
定
,
上游引物
(
F
:
5'-CATATGCTTACCGTAACT-
,。
对敲除载体
p
自然冷却
23min0minGK1.1
()
图
1
进行酶切
,
使其线性化
。
酶切反应体系
37℃
孵育
4h
。
酶切完成后进行
1.5%
琼脂糖凝胶
电泳
,
并用
DNA
纯化回收试剂盒对产物进行纯化
回收
,
―
20℃
保存备用
。
载体进行连接
,
反应体系
20
μ
L
:
T4DNA
连接酶
双链
1
μ
L
,
T4DNA
连接酶
Buffer
(
10×
)
2
μ
L
,
1.2.3
阳性重组质粒筛选
从―
80℃
冰箱中取
出大肠杆菌
T
置于冰上融化
;
取
o10
感受态细胞
,
p
,,
线性载体
p
DNA50nGK1.150nddH
2
O
补足
gg
体系
。
16℃
孵育过夜
。
,
50
μ
L
:
GK1.1
载体
2
μ
Bbs
Ⅰ
限制性内切酶
pg
1
μ
L
,
10×NEBBuffer5
μ
L
,
ddH
2
O
补足体系
。
将退火得到的杂交双链
DNA
和线性化
p
GK1.1
菌液
2
μ
20
μ
L
:
L
,
dNTPs2
μ
L
,
10×Buffer2
μ
L
,
上
、
下游引物各
1
μ
Ta
2
μ
L
,
L
,
ddH
2
O
补足
q
酶
0.
;
体系
。
PCR
反应程序
:
95℃
预变性
10min95℃
变
,,,
性
3
共
35s60℃
退火
35s72℃
延伸
35s5
个循
。
P
环
;
72℃
延伸
10minCR
产物经
1.5%
琼脂糖凝
胶电泳检测
,
筛选出阳性菌落
,
送生工生物工程
(
上
海
)
股份有限公司进行测序
。
使用无内毒素质粒小
提试剂盒提取阳性克隆质粒
,
测定浓度备用
。
896
中
国
畜
牧
兽
医
51
卷
图
1
p
GK1.1
载体序列图谱
Fi.1 Seuencemaor
p
GK1.1
p
lasmid
gqp
f
etPRIME
试剂将阳性重组质粒和对照质粒分别转
j
/
染至
I
用
3
μ
PEC-J2
细胞
;
mL
嘌呤霉素进行药
g
至
2
分离出部分细胞进一步检测敲除效率
。
4
孔板
,
1.2.4
单克隆筛选
将
IPEC-J2
细胞接种至
6
孔培养板中
,
在细胞汇合度达
70%
时
,
使用
,
离心
2
取上清
;
根据
B0minCAProteinAssait
y
K
说明书测定蛋白浓度并记录
,
以每组
10
μ
g
蛋白的
湿转法进行转膜
,
将
P10%SDS-PAGE
,
VDF
膜取
出置于摇床上
,
用
TBST
清洗
;
5%
脱脂奶粉封闭
;
将蛋白样品进行
Buffer
稀释
,
98℃
加热
10min
标准来计算所需蛋白溶液的体积
,
加入
5×Loadin
g
筛
,
分离部分细胞用于敲除效率检测
;
对阳性敲除细
胞使用有限稀释法进行单克隆细胞筛选
,
待细胞长满
1.2.5
阳性敲除细胞鉴定
利用
Primer
Premier5.0
软件设计敲除靶位点特异性扩增引物
,
基因组
DPCR
反应体系
25
μ
L
:
NA1
μ
L
,
2×
Ta
q
上
、
下游引物各
Mix12.5
μ
L
,
25
μ
L
,
引物序列为
:
F
:
5'-GGACTTCGGAGGACCTCT-
;。
GA-3'R
:
5'-CCACCCACAGAAGCCCACTA-3'
用含有
0.
加入鼠
2h
,
1%Tween-20
的
TBST
清洗
,
抗
KLF4
一抗在
4℃
摇床上孵育过夜
,
TBST
清洗
;
加入山羊抗小鼠
I
二抗孵育
2h
,
G
(
H+L
)
TBST
g
清洗
,
加入
E
进行曝光拍照
。
CL
显影液
,
3
和野生型细胞分别以
2×1
个的密度接种于
906
孔
1.2.7
细胞活性试验
将
KLF
4
基因敲除细胞
板
,
置于培养箱中培养
,
在
12
、
24
和
48h
时分别收
标仪上读取
4
计算细胞活性
。
50nm
吸光度
,
;,,
5min95℃
变性
10s60℃
退火
10s72℃
延伸
,;
共
310s5
个循环
;
72℃
延伸
5min95℃
孵育
酶切鉴定阳性克隆
,
反应体系
10
μ
L
:
PCR
产物
ddH
2
O
补足体系
。
PCR
反应程序
:
95℃
预变性
集细胞
,
添加
C
在酶
CK-8
试剂于培养箱内孵育
2h
,
细胞活力
=
试验孔
D
450nm
值―空白孔
D
450nm
TM
3min
后自然冷却至室温
。
使用
CruiserEnzme
y
TMTM
酶
1
μ
缓冲液
2
μ
2
μ
L
,
CruiserL
,
5×CruiserL
,
,
加
ddH
2
O
补足体系
。
反应条件
:
45℃
孵育
20min
入
2
μ
L6×Buffer
终止反应
。
产物经
1.5%
琼脂糖电
泳检测后对初步筛选出的阳性克隆进行测序验证
。
1.2.8
利用流式细胞术分析细胞周期
将细胞
接种至
6
孔板培养
,
当细胞汇合度达
80%
左右时
,
用胰酶消化细胞并收集到
1.
离心
5mL
离心管中
,
弃上清
;
沿管壁加入
1m
离心弃上
L
预冷的
PBS
,
清
;
沿管壁加入
1m
轻吹混匀
,
L70%
乙醇
,
4℃
固定
过夜
,
离心弃上清
;
加入
1m
重悬细
L
预冷的
PBS
,
胞并离心收取细胞沉淀
;
向细胞溶液中加入碘化丙
细胞
、
培养基及
C
空白孔具有培养基和
CK
溶液
,
CCK
溶液而没有细胞
。
值
,
其中试验孔具有
KLF
4
基因敲除细胞或野生型
1.2.6 Westernblottin
g
检测
将细胞置于
6
孔
板中培养
,
待细胞长满后弃去培养基
,
用预冷的
PBS
洗涤
2
次
,
加入
200
μ
LRIPA
及
2
μ
L
蛋白酶抑制
,/
剂
,
置于冰上裂解
3
收集细胞
,
0min4℃
、
12000rmin
3
期
/
董
娇等
:
基于
CRISPRCas9
技术构建猪
KLF
4
基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析
897
啶染色液
,
缓慢充分重悬细胞沉淀
,
37℃
孵育
;
染色后在
230min4h
内用流式细胞仪在波长
利用
M488nm
处检测红色荧光
,
odFit
软件对结果
进行分析
。
1.3
数据统计分析
使用
R
(
软件包中
t
检验分析
K
v3.2.5
)
LF
4
基因敲除细胞和野生型细胞之间的差异显著性
,
结
果以平均值
±
标准差表示
,
P
<0.05
表示差异显著
;
(),
图
3
表明
KLF
4
基因敲除质粒构建成功
。
基因序列与
p
GK1.1
载体及
sRNA
序列相吻合
g
P
<0.01
表示差异极显著
。
2
结
果
2.1
猪
KLF
4
基因敲除细胞系的建立
/
2.1.1 CRISPRCas9
敲除载体构建
对
sRNA
向导序列与线性化
p
GK1.1
载体连接产物
g
进行菌落
PCR
鉴定
,
1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测结
阳性克隆提取质粒后测序结果显示
,
阳性打靶载体
。
果显示均能扩增出
1
图
2
)
00b
p
大小的目的片段
(
;
阳性菌落
P
阴
M
,
100bNAMarker1
、
2
,
CR
扩增产物
;
3
,
p
D
性对照
;
M
,
100bNAMarker1and2
,
PCRamlification
p
roducts
p
D
p
图
2
菌落
PCR
琼脂糖凝胶电泳检测
;
of
p
ositivecolon3
,
Neativecontrol
yg
Fi.2 PCRaarose
g
elelectrohoresisdetectionofcolon
ggpy
矩形框内为
sA~C
,
sRNA1
、
sRNA2
、
sRNA3
对应打靶载体测序峰图
;
RNA
序列
gggg
seuencesweremarkedwiththerectanularbox
qg
图
3
菌落
PCR
阳性质粒测序峰图
;
A-C
,
TheseuencineakmaftaretvectorcorresondinosRNA1
,
sRNA2andsRNA3
,
resectivelsRNA
qgpp
o
gpg
t
gggpyg
Fi.3 Seuencineakmaf
p
ositive
p
lasmiddetectedbolonCR
gqgpp
o
y
c
y
P
898
中
国
畜
牧
兽
医
51
卷
2.1.2
KLF
4
基因敲除载体筛选及阳性克隆鉴定
、、
将含有
sRNA1sRNA2sRNA3
的敲除质粒转
ggg
/
染
I
使用
3
μ
PEC-J2
细胞
,
mL
嘌呤霉素进行药筛
,
g
获得表达载体的阳性细胞
。
PCR
扩增混合细胞基因
),
组敲除靶位点序列
,
获得
3
图
426b
p
的基因片段
(
与预期长度一致
。
对
PCR
产物测序初步验证敲除效
),
率
,
发现
3
个
s
图
5
其中
RNAs
靶位点处均有套峰
(
g
克隆细胞
。
提取单克隆细胞基因组
,
PCR
扩增靶位点
TM
序列
,
使用
C
酶对长度
3ruiser26bCR
产物进
p
的
P
sRNA3
靶位点处底峰较高
。
对转染
sRNA3
的混
gg
合细胞挑取单克隆细胞进行扩大培养
,
共获得
8
个单
行酶切验证
,
结果显示有
2
株单克隆细胞发生基因敲
;
M
,
DL1000DNAMarker1~3
,
KLF
4
基因敲除靶位点
PCR
;
M
,
DL1000DNAMarker1-3
,
PCRamlificationresultsof
p
图
4
KLF
4
基因敲除靶位点
PCR
扩增产物琼脂糖凝胶电
泳检测
Fi.4 AaroseelelectrohoresisofPCRamlification
p
roducts
gggpp
of
KLF
4
g
eneknockouttaretsites
g
扩增结果
;
阴性对照
4
,
);
除
(
图
6
图
PCR
测序在敲除靶位点处有明显双峰
(
),
表明获得的单克隆细胞发生了基因敲除
。
T7A
克
;
KLF
4
g
eneknockouttaretsites
4
,
Neativecontrol
g
g
隆测序分析显示
,
送检的
7
个
TA
克隆中有
4
个发生
,
序列缺失
(
阳性率
5
缺失序列长度分别为
17.1%
)
16
),
和
1
图
8
表明成功构建
K
37b
LF
4
基因敲除细胞
。
p
(
图
5
转染
3
个
sRNAs
的混合细胞克隆靶位点
PCR
产物测序峰图
g
Fi.5 SeuencineakmaftaretsitesPCR
p
roductsofmixed-cellstransfectedwith3sRNAs
gqgpp
o
gg
TM
;
不同克隆细胞
CM
,
DL1000DNAMarker1~6
,
ruiserenzme
酶切产物
y
TM
图
6 Cruiserenzme
酶切筛选阳性克隆细胞
y
TM
;
M
,
DL1000DNAMarker1-6
,
The
p
roductsofdifferentcellclonesdiestedbruiserenzme
gy
C
y
TM
Fi.6 Selectionof
p
ositivecellclonesbruiserenzmediestion
gy
C
yg
3
期
/
董
娇等
:
基于
CRISPRCas9
技术构建猪
KLF
4
基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析
899
图
7
阳性细胞克隆测序峰图
Fi.7 Seuencineakmaf
p
ositivecellclones
gqgpp
o
右侧碱基数为缺失序列数目
Thebasenumberontherihtisthenumberofmissineuences
gg
s
q
图
8
KLF
4
基因敲除细胞缺失序列
Fi.8 Deletionseuencesof
KLF
4
g
eneknockoutcells
gq
2.1.3
KLF
4
基因敲除细胞蛋白表达检测
提
取
KLF
4
基因敲除细胞及野生型细胞蛋白进行
结果显示
,
Westernblottin
KLF
4
基因敲除
g
分析
,
,
细胞中未见
K
图
9
)
表明成功构建
LF4
蛋白表达
(
猪
KLF
4
基因敲除细胞系
。
900
中
国
畜
牧
兽
医
51
卷
野生型和
KLF
4
基因敲除细胞中的周期蛋白经
在
K
Westernblottin
LF
4
基因敲除
g
检测结果显示
,
细胞中
,
反映细胞增殖状态的
PCNA
蛋白表达量下
+
KLF4
+
KLF4
/
+
/
,
野生型
IPEC-J2
细胞
;
KLF4
--
,
KLF
4
基因敲除
-
/
-
,;,
WildteIPEC-J2cellsKLF4IPEC-J2cells
yp
降
,
促进
G1
期向
S
期转化的
CDK4
蛋白表达量下降
,
)。
阻滞细胞周期进程的
P
图
121
蛋白表达上升
(
2
的
IPEC-J2
细胞
。
下同
/
+
with
KLF
4
g
easbelow
图
9 WesternblottinLF4
蛋白表达
g
检测
K
Fi.9 ExressionofKLF4
p
roteindetectedbesternblottin
gpy
W
g
2.2
KLF
4
基因敲除对细胞活性及细胞周期的影响
利用
CCK-8
试验检测
KLF
4
基因敲除对细胞
KLF
4
基因敲除细胞的活性极显著低于野生型细胞
(,
图
1
表明
KP
<0.01
,
0
)
LF
4
基因敲除可以抑制
细胞活性
。
活性的影响
,
结果显示
,
在培养
12
、
24
和
48h
时
,
;;,
差异显著
(
差异极显著
(
差
*
,
P
<0.05
)
**
,
P
<0.01
)
ns
)。
下同
异不显著
(
P
>0.05
;
*
,
Sinificantdifferences
(
P
<0.05
)
**
,
Extremel
gy
);)()。
图
10.01G2
期细胞数量无显著变化
(
P
>0.05
1
基因敲除的
IPEC-J2
细胞中处于
G1
期细胞数量极显
);
著上升
(
P
<0.01
S
期细胞数量均极显著下降
(
P
<
利用流式细胞术检测细胞周期
,
结果显示
,
KLF
4
;
n
,
Nsinificantdifferences
(
P
<0.01
)
sosinificant
gg
)
differences
(
P
>0.05
.Thesameasbelow
图
10
KLF
4
基因敲除后细胞活性检测
Fi.10 Cellviabilitetectionafter
KLF
4
g
eneknockout
gy
d
A
、
B
,
KLF
4
基因敲除及野生型细胞周期的流式分析结果
;
C
,
G1
、
G2
、
S
各时期细胞比例
图
11
KLF
4
基因敲除后细胞周期检测
;
AandB
,
Cellccleanalsisof
KLF
4
g
eneknockoutandwildtecellsblowctometrC
,
CellratioatG1
,
G2andSstaes
yyypy
f
yyg
Fi.11 Cellccledetectionafter
KLF
4
g
eneknockout
gy
3
期
/
董
娇等
:
基于
CRISPRCas9
技术构建猪
KLF
4
基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析
901
图
12
KLF
4
基因敲除对细胞周期蛋白表达的影响
Fi
g
.12 Effectsof
KLF
4
g
eneknockoutontheex
p
ressionof
cellc
y
cle
p
roteins
讨
CR
论
ISPR
/
Cas9
系统具有靶点分布频率高
、
片段
插入精确性高及能够实现多个位点高效切割等优
点
,
比
型家畜的育
ZFNs
和
种
,
T
且
A
在
LE
猪
N
遗
s
基因编辑技术更适合于大
传育种研究中广泛应用
。
研究人员利用
CRISPR
/
Cas9
技术在猪肌细胞
、
肺
泡巨噬细胞
、
小肠上皮细胞等多种细胞类型中已成
功构建了
CD
163
氧化物酶体增殖物激活受体
、
胰岛素样生
(
γ
(
长
PP
因
A
子
Rγ
2
)
(
I
、
G
氨肽酶
F2
)、
过
N
备了基因编辑猪
APN
)、
Toll
样受体
,
极大地促进了上述基因功能机制
5
(
TLR5
)
等基因编辑细胞并制
研究及其在猪育种中的应用
[
11-15
]
锌指结构的转录因子家族成员
,
在基因表达调控
。
KLF4
作为具有
、
细
胞分化
、
机体免疫应答及氧化应激反应等生物过程
中具有广泛的调节作用
[
16
]
激活病毒即刻早期基因
BZ
。
LF
K
1
LF
和
4
可通过结合并
BRLF
1
基因启
动子
,
从而诱导
Estein-Barr
病毒
[
17
]
K
其招募
LF4
可通过结合
β
p
的再活化
-
干扰素
(
IFN
β
)
基因启动子阻遏
。
负
IR
调
F3
因子
,
进而抑制
IFN
控水疱性口炎病毒刺激
β
及下游基因的
表达
,
引发的免疫反
应
[
18
]
。
因此
,
KLF4
可直接调控病原基因及宿主免
疫应答相关基因的表达
。
本研究使用的
胞在基因功能解析
、
病原感染调控及细胞代谢等研
IPEC-J2
细
究中应用广泛
[
19
]
。
作为研究模型
,
IPEC-J2
细胞已
应用于猪大肠杆菌
塔冠状病毒等病原致病机制及宿主抗性基因鉴定研
F18
、
猪流行性腹泻病毒
、
猪德尔
究
[
20-22
]
的仔猪空肠组织中
。
转录组研究发现
KLF
4
,
基因表达水平显著升高
猪流行性腹泻病毒感染
,
表明其可能参与调控猪流行性腹泻病毒感染宿主细
胞
,
而其具体作用尚不明确
[
23
]
CRISPR
/
Cas9
技术构建了
KLF
4
。
基
本
因
研
敲
究
除
利
的
用
PEC-J2
细胞
,
可为深入探究
KLF
4
基因在猪病原
感染相关基因表达调控中的功能与作用机制
,
以及
制备
KLF
4
基因编辑猪提供材料
。
KLF
4
基因是调控细胞周期进程的关键调节因
子
,
其在
期细胞周
D
期
NA
损伤过程中可调控
阻滞
[
24
]
。
KLF
4
基因
p
可
53
依赖的
在转录水
G
平
1
/
和
S
转录后翻译修饰水平发挥调节功能
[
25
]
滑肌细胞中研究表明
,
磷酸化的
。
在血管平
募集到
过将其阻滞在
p
21
启动子区从而启动
G1
p
K
21
LF
基因的表达
4
可促进
p
3
,
0
通
0
期并促进细胞分化来抑制血管平
滑肌细胞的周期进程
[
26
]
中发现
,
KLF
4
基因敲除
。
细
本
胞
研
中
究
G1
在
期
IP
细
EC
胞
-J2
细胞
比例极
显著上升
,
向
S
期转化的
S
期细胞比例极显著下降
,
并促进
P21
C
蛋
D
白
K4
蛋白表达量下降
,
阻滞细胞周
G1
期
期进程的表达上升
。
综合前人研究及本
试验结果可见
,
KLF4
在不同细胞类型中可能通过
不同的分子网络调控细胞进程
。
本研究构建了猪
KLF
4
基因敲除的
型进一步探究
KLF
I
4
PE
基
C-
可作为研究模
因
J2
细胞系
,
调控肠道上皮细胞周期
进程的分子机制
。
结
论
本研究利用
KLF
4
基因敲除的
CRISPR
/
Cas9
技术成功构建了
分别缺失
细胞活性
1
,
1
并引起细胞
6
和
13
I
7b
PE
p
C-J2
细胞系
,
G0
。
其双等位基因
/
S
敲
期周期阻滞
除
KLF
4
基因可抑制
。
参考文献
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K
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