2024年4月10日发(作者：)

引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，

所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，由

于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采

用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。在体外PCR反应中所用到

的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后

在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反 应，决定整个反应成功与否

的最重要因素是引物的序列和质量。

1. 不同实验要求的引物选择

在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：

（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）

（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）

（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需

要考虑可能存在的问题（如假基因等）

2.引物设计的重要因素

有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，

Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提

供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus，

引物长度和专一性

常见的引物长度为18-30个碱基。 短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的

专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。同时应避免

编码单一序列和重复序列的引物。

平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域

引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们

会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模

板复合物，从而降低扩增效率。

3’-序列

 3’端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它将提高PCR效率，因为引物-模板符合

物的开放将达到最小。但是，超过3个G/C碱基将会具有负面效果，因为会降低反应的专一性。

避免互补的引物序列

引物设计应避免引物自身序列的互补性超过3个碱基。因为这容易使引物形成自身发夹结

构。

上下游引物之间的互补配对也应避免，尤其在作为扩增起始点和关键区域的3’端。因为这将导致

强引物二聚体形成，后者将与所需要的PCR反应竞争资源，导致PCR效率降低，在极端情况下，

甚至导致完全无特异性目的产物生成。

退火温度是基于引物的解链温度（Tm）------计算方法。

最常用的解链温度计算公式如下三种：“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于14个碱基以下

引物有效，

另外，还有GC法则，适用于长于13个碱基的序列，这两种方法都相对不准确。

“盐调整”法相对准确一些，考虑到了反应缓冲液中的中的Na+离子浓度(50 mM Na+ ,pH 7.0)。

但是不管根据哪种方法计算出的解链温度，都可用于估算最佳退火温度，也都仅作为实验参考温

度。

Q-1：OD值的概念？

A-1: OD是optical delnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，OD＝1og（1／trans），

其中trans为检测物的透光值。 吸光度（absorbance），是指光线通过溶液或某一物质前的入射

光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度

等等，吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物

质，吸光系数就不变。引物是以OD260值来计量的。在1ml的1cm光程标准石英比色皿中，260nm

波长下吸光度为1的引物溶液定义为1 OD260。虽然对于每种特定的寡核苷酸来说，其碱基的组成

不尽相同，但1 OD260 引物的重量约为33ug，每个碱基的平均分子量约为330 Da。因此合成的

引物摩尔数可按以下公式近似计算： 摩尔数(mol) = [OD值*33]/[碱基数*330] = 0.1* [OD值/碱基

数]。

Q-2：需要合成多少OD的引物？

A-2: 一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ul标准PCR反应，以及 2000～2500 次的

测序反应。因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。如果是做基因拼接或退火后做连接，

1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的

纯度。为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。

Q-3：如何测定引物的OD值?

A-3: DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，

测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每

毫升溶液中的OD值。例如：您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。取该母液50μL

稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也

即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

Q-4：最长可以合成多长的引物？

A-4:引物越长，出现问题的概率就越大。除非需要，建议合成片段长度不要超过80碱基，如果您

的实验需要，我们可以接受110 碱基以下的订单。