2024年4月10日发(作者：)
•
72
•
中国免疫学杂志
2021
年第
37
卷
doi
:
10.
3969/j.
issn.1000484X.
2021.01.
013
miRNA-7
靶向
SP1
的
3'UTR
双荧光素酶报告基因载体构建及评价
①
刘文莉国东
②
刘加霏
②
王玉珊
②
张焕虎
②
宋文刚
(
北华大学医学技术学院
，
吉林
132013)
中图分类号R735.
2
文献标志码
A
文章编号
1000-484X(
2021
)
01-0072-06
[摘
要
]
目的
:
构建胃癌细胞核转录因子
SP1
的
3'
非翻译区
(
3
忆
UTR)
双荧光素酶报告基因载体
，
验证
microRNA-7
(miR-7)
调控
SP1
的分子机制
。
方法:
应用相关生物信息学软件预测
miR-7
靶向作用于
SP1
基因的
3'UTR
区
；
PCR
扩增人胃
黏膜上皮细胞
SP1
的
3'UTR
，
插入至
psiCHECK2
载体双荧光素酶基因下游
，
构建野生型
(w-3'UTR)
和突变型重组表达载体
(m-3'UTR)
，
鉴定正确后
，
分别与
miR-7
模拟物
(
mimics)/
抑制物
(
inhibitor)/
阴性对照物
(
NC)
共转染胃癌细胞
MKN45
，
检测荧
光素酶活性及
SP1
表达情况
。
结果
:
成功构建
SP1
的
3'UTR
野生型
(
psiCHECK2-SP1-w-3'UTR)
和突变型
(
psiCHECK2-SP1-m-
3'UTR)
表达载体
，
双荧光素酶报告基因检测显示
w-3'UTR/miR-7-mimics
组的相对荧光素酶活性表达受抑制
，
与
miR-7
NC
组
比较降低
75%
，
差异具有统计学意义
(
P
<0.
001)
，
而
m-3'UTR/miR-7-mimics
组的活性表达没有受到影响
(
P
>0.
05)
。
RT-PCR
和
Western
blot
检测结果显示
miR-7-mimics
组
SP1
表达水平低于
miR-7
NC
组
(
P
<0.
001),
而
miR-7-inhibitor
组
SP1
表达水平
高于
miR-7
NC
组
(
P
<0.
001)o
结论:
成功构建
SP1
的
3'UTR
野生型双荧光素酶报告基因表达载体
,
miR-7
能够显著降低其荧
光素酶活性
，
提示
miR-7
能靶向负调控
SP1
的表达
。
[
关键词
]
microRNA-7
；
SP1
基因
；
双荧光素酶报告系统
;MKN45
；
胃癌
Construction
and
evaluation
of
dual-luciferase
reporter
gene
vector
based
on
miRNA-7
targeting
nuclear
transcription
factor
SP1-3'UTR
LIU
Wen-Li
,
GUO
Dong
,
LIU
Jia-Fei
,
WANG
Yu-Shan
,
ZHANG
Huan-Hu
,
SONG
Wen-Gang.
School
of
Medical
Technology
,
Beihua
University
,
Jilin
132013
,
China
[
Abstract
]
Objective
:
To
construct
the
dual
luciferase
reporter
plasmid
psiCHECK2-SP1
-w-3
'UTR
and its
mutant
plasmid
psi-
CHECK2
-SP1
-m-3
'UTR
in
order
to
clarify
the
molecular
mechanism
of
microRNA-7
(
miR-7
)
regulating
gastric
cancer
cell
SP1
expression.
Methods
:
Relevant
bioinformatics
software
was
used
to
predict
miR-7
targeting
the
3'
UTR
region
of
SP1
gene.
The
full
sequence
of
SP1
3'UTR
gene
was
amplified
and
inserted
into
the
downstream
of
luciferase
gene
in
psiCHECK2
vector.
A
wild
type
of
dual
luciferase
reporter
plasmid
of
psiCHECK2-SP1
-w-3
'
UTR
was
constructed.
Meanwhile
,
a
modified
type
of
dual
luciferase
reporter
plasmid
psiCHECK2-SP1-m-3'
UTR
was
constructed
by
fusion
PCR.
When
both
of
vectors
were
verified
by
PCR,
restriction
endonuclease
and
DNA
sequencing
to
be
true,
they
were
cotransfected
into
gastric
cancer
MKN45
cells
with
miR-7
mimics,
miR-7
inhibitor
and
miR-7
NC
totally.
Afterguards
,
the
relative
luciferase
activity
and
SP1
was
detected.
Results
:
The
two
kinds
of
double
luciferase
reporter
plasmid
psiCHECK2-SP1-w-3'
UTR
and
its
mutant
plasmid
psiCHECK2-SP1-m-3'
UTR
were
constructed
and
confirmed
by
enzyme
digestion
and
sequences.
The
double
luciferase
reporter
experiment
showed
that
overexpression
of
miR-7
could
sig
nificantly
inhibit
the
relative
luciferase
activity
of
psiCHECK2-SP1-w-3'
UTR,
and
the
difference
was
statistically
significant
(
P
<
0.
001)
,
with
no
effect
on
the
expression
of
psiCHECK2-SP1
-m-3
'UTR
(
P
>0.
05).
Rt-PCR
and
Western
blot
results
showed
that
SP1
expression
level
of
miR-7-mimics
group
was
lower
than
that
of
miR-7
NC
group
(
P
<
0.
001
)
,
while
SP1
expression
level
of
miR-7-
inhibitor
group
was
higher
than
that
of
miR-7
NC
group
(
P
<0.
001).
Conclusion
:
We
successfully
constructed
the
dual
luciferase
reporter
plasmid
and
its
mutant
plasmid
based
on
psiCHECK2-SP1-3'UTR,which
can
be
used
to
elucidate
the
molecular
mechanism
of
miR-7
regulating
gastric
cancer
cell
SP1
expression.
[
Key
words
]
microRNA-7
；
SP1
；
Dual
luciferase
reporter
plasmid
；
MKN45
；
Gastric
cancer
①
本文为北华大学研究生创新项目
(
北华研创合字
[2019]074)
；
威海市医学微生物与免疫学重点实验室项目
(
2017GGH08)
；
山东省自然科学
基金
(
ZR2020QC073)
。
②
山东大学附属威海市立医院中心实验室
，
威海
264200o
作者简介
：
刘文莉
，
女
，
在读硕士
，
主要从事微生物检验方面的研究
：
liuwenli52@163.
com
。
通信作者及指导教师
:
张焕虎
，
男
，
医学硕士
，
教授
，
硕士生导师
，
主要从事胃肠道疾病机制研究与临床应用方面的研究
，
：
whzhanghuanh
u@
163.
com
。
宋文刚
，
男
，
医学博士
，
教授
，
硕士生导师
，
主要从事分子免疫学方面的研究
，
就职于北华大学医学院
，
吉林
132013,
：
1844901447@
qq.
com
。
刘文莉等
miRNA-7
靶向
SP1
的
3'LTR
双荧光素酶报告基因载体构建及评价
第
1
期
•
73
•
SP1
属于
SP/KLF(Kruppel-like
factor
)
转录因子
体
psiCHECK2
由威海市立医院中心实验室馈赠
。
1.1.
2
细胞株
健康人胃黏膜上皮细胞
GES-1
细
家族
，
可通过调节癌基因及抑癌基因
、
肿瘤细胞凋亡
等方式
，
调控多种肿瘤细胞生长周期相关信号传导
途径
［
1
］
。
研究发现
SP1
与胃癌的发生发展密切相
关
，
在胃癌患者中
，
SP1
高表达患者的生存时间明显
胞株
、
人胃癌细胞株
MKN45
购于上海中科院细
胞库
。
1.1.3
仪器设备
MCO-18AIC
细胞培养箱
(Panas
onic
,
Japan
)
；
ChemiDoc
XRS
+
化学发光成像系统
、
Synergy
H4
多功能酶标仪
、
荧光定量
PCR
仪
(Bio-Rad,
低于弱表达或者低表达的患者
，
下调
SP1
的过表达
可以抑制胃癌肿瘤的增殖和瘤细胞的形成
［
2
］
。
微小
RNAs
(microRNAs
)
是真核细胞生物内源
USA)
；
Nano-200
超微量核酸分析仪
(
奥盛
，
广州)
。
1.
2
方法
1.
2.
1
microRNA-7
靶基因预测
利用
Targetscan
性的具有调控功能的非编码
RNA,
其成熟体通过碱
基互补配对的方式识别靶
mRNA,
根据互补的程度
指导沉默复合体降解靶基因或阻碍
mRNA
的翻
译
［3
］
。
miR-7
自
2001
首次在果蝇中发现以来
，
在许
多癌症中表达降低
,
发挥抑癌基因的作用⑷
。
最近
研究发现
,miR-7
在胃癌组织和胃癌细胞中均显著
下调
，
已逐渐成为胃癌诊断和治疗的靶标
［5
］
。
miR-
7
可通过抑制
mTOR
(
mechanistic
target
of
rapamycin
)
的表达
，
增强胃癌细胞对顺铂的敏感
性
［6
］
;
通过抑制上皮生长因子受体和胰岛素样生长
因子
1
受体的表达
，
抑制胃癌细胞的侵袭和转移能
力
［7
］
。
基于上述理论
,miR-7
与
SP1
可能存在某种
联系
，
但目前没有关于
miR-7
作用于
SP1
对胃癌参
与调控的相关研究报道
。
本研究拟通过构建双荧光素酶报告质粒及突变
质粒
,
以阐述
miR-7
调控胃癌细胞
SP1
表达的分子
机制
，
为研究
miRNAs
在胃癌中的作用提供新的
思路
。
1
材料与方法
1.
1
材料
1.1.
1
主要试剂
细胞总
RNA
抽提取试剂盒
、
质
粒抽提试剂盒
、
通用型
DNA
纯化回收试剂盒购于
TIANGEN
公司
；
50
bp
DNA
ladder,
D2000
DNA
Marker
、
1
kb
plus
DNA
ladder
、
Pro-Light
HRP
化学发
光检测试剂购于天根生化科技
(
北京
)
有限公司
；
实
时荧光定量
PCR(qPCR)
试剂盒
、
cDNA
合成试剂
盒
、
2xTaq
酶
、
DNA
聚合酶
、
dNTP
、
T4
连接酶
、
限制
性内切酶
Xho
I
、
Not
I
购于宝日医生物技术
(
北京
)
有限公司
；
miR-7
mimics
、
mimics-NC
、
miR-7
inhibitor
购于上海吉玛制药技术有限公司
；
1640
培养基
、
胎
牛血清
(
fetal
bovine
serum,FBS)
购于
TaKaRa
公司
；
Lipofectamine
2000
购于美国
Thermo
Scientific
公司
；
BCA
蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天公司
；
SP1
抗
体
、
GAPDH
抗体及二抗均购于武汉三鹰公司
；
PCR
引物合成及测序由北京
Thermo
Scientific
公司完成
。
大肠埃希菌感受态细胞
DH5
琢及双荧光素酶报告载
(http
：
//www.
targetscan.
org/vert_72/)
和
miRDB
(
http
:
//mirdb
.
org/
)
生物信息学技术相关软件预测
miR-7
的靶基因以及
miR-7
与
SP1-3'
UTR
序列配对
分析
。
1.2.2
GES-1
细胞的培养和基因组
DNA
提取
GES-1
细胞株培养于
1640
培养基
(
含
10%
胎牛血
清
+1%
的青霉素
/
链霉素双抗
)
,37
益
、
5%
C0
2
培养
箱
。
当细胞汇合度为
80%
时
，
收集细胞
，
用细胞基
因组快速抽提试剂盒
，
按照说明书提取细胞基因组
DNA,
用
2%
凝胶电泳检测
DNA
完整性并用超微量
核酸分析仪检测浓度
。
1.2.3
PCR
扩增
SP1-3'UTR
基因片段
从
NCBI
数
据库中下载人源
SP1
基因序列
(
NM_138473.3)
，
应用
Prime
primer5.
0
软件设计
SP1-3'UTR
特异性引物
,
在
引物的前端加入
Xho
I
和
Not
I
两个限制性内切酶位
点和保护性碱基
(
表
1)
。
以提取
GES-1
细胞的基因
组
DNA
为模板
,PCR
扩增
SP1-3'UTR
区
miR-7
结合
位点
。
PCR
体系
：
2xTap
10
滋
l,
上引物
0.5
滋
l
，
下引物
0.5
滋
l,
模板
2
滋
l,
水
8
滋
l
。
PCR
反应条件为
:
94
益预
变性
5
min
；
95
益变性
30
s,58
益退火
30
s,72
益延伸
15
s,
共
35
个循环
;
最后
72
益延伸
5
min
。
用
1.5%
的
琼脂糖凝胶电泳鉴定
PCR
产物
。
使用凝胶回收试剂
盒回收目的片段
，
用于后续连接反应
。
表
1
用于扩增
SP1及
3
忆
UTR
特异性引物序列
Tab.
1
Oligonucleotide
primers
for
SP1
and
3'UTR
used
in
PCR
Primer
namePrimer
sequence(5'-3')
SP1-w-3'UTR-F
CCGCTCGAGCGTCATGTGCTCAGAAGAGGAAAT
SP1-w-3'UTR-R
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATATTCACTGG-
CTGATGCTCC
SP1-m-3'UTR-R1
AAACTTAGAGCTACCTACCTTGACA
SP1-m-3'UTR-F1
TGTCAAGGTAGGTAGCTCTAAGTTT
RT-SP1-F
GTGGAGGCAACATCATTGCTG
RT-SP1-R
GCCACTGGTACATTGGTCACAT
Note
:
SP1-W-3'UTR-F
underline
:
XhoI
restriction
site
；
SP1-W-3
'
UTR-R
underline
:
Not
I
restrictin
site.
-
74
-
中国免疫学杂志
2021
年第
37
卷
1.2.
4
野生型表达载体
psiCHECK2-SP1-w-3'UTR
的
1.
2.
9
Western
blot
检测
SP1
的表达变化
提取待
构建及鉴定
将
PCR
产物纯化后采用
Xho
I
和
Not
I
分析细胞的总蛋白
，
并用
BCA
蛋白浓度测定试剂盒
双酶切
37
益过夜
。
回收酶切片段
，
插入到荧光素酶
报告载体
psiCHECK2
的对应位点
，
连接体系如下
:
3'UTR
7
滋
l,XhoI
、
NotI
双酶切纯化
psiCHECK2
1
滋
l,
10xT4
DNA
buffer
1
滋
l,T4
连接酶
1
滋
l,
水补至
10
滋
l,
16
益连接过夜
。
转化
DH5
琢感受态细胞
，
挑取单菌落
测定蛋白浓度
。
GAPDH
作为内参
。
上样
30
滋
g
蛋白
进行电泳
，
通过湿转法将蛋白转到
PVDF
膜上
,5%
脱
脂奶粉中
37
益封闭
1
h
后添加一抗
,4
益孵育过夜
,
TBST
漂洗
4
次后添加辣根过氧化物酶
HRP
标记的
二抗
，
室温孵育
1
h
后
TBST
漂洗
4
次
,
最后采用
Pro
Light
HRP
化学发光检测试剂盒显色
，
并用
ChemiDoc
接种于氨苄抗性的
LB
液体培养基中培养筛选阳性克
隆
,
按照
DNA
提取试剂盒说明书步骤
，
提取
psiCHECK2-SP1
-w-3
'UTR
质粒进行
Xho
I
.Not
I
酶切
XRS+
化学发光成像系统采集图像
。
1.
3
统计学分析
研究中所有数据采用
SPSS17.
0
鉴定
,
将鉴定正确的质粒送去生工生物工程公司
（
上
海
）
测序
。
1.
2.
5
突变型表达载体
psiCHECK2-SP1-m-3'UTR
的
构建及鉴定
以
1
・
2.4
中构建的
psiCHECK2-SP1-w-
3'UTR
为模板
，
分别以
SP1-w-3'UTR-F
和
SP1-m-3'
UTR-R1
为引物扩增片段
F1,
SP1-m-3'UTR-F1
和
SP1-w-3'UTR-R
为引物扩增片段
F2,
再以
F1
和
F2
为
模板
，
以
SP1-w-3'UTR-F
和
SP1-w-3'UTR-R
为引物
，
通过融合
PCR
技术扩增
F3
片段
（
对
miR-7
的结合位
点进行了连续
4
个碱基突变
）
，
经回收
、
酶切和纯化后
插入到双荧光素酶报告载体
psiCHECK2
的对应位
点
，
转化感受态细胞,筛选阳性克隆
，
经测序后保存
。
1.2.6
细胞分组及转染
将
MKN45
细胞接种于
12
孔板中
，
每孔
2x10
6
个细胞
，
培养过夜
,
当细胞密度达
到
70%
〜
80%
时
,
分别将
:
psiCHECK2-SP1-w-3
'
UTR
和
miR-7
mimics
,
psiCHECK2-SP1
-m-3
'
UTR
和
miR-7
mimics
,
psiCHECK2-SP1
-w-3
'
UTR
和
miR-7
inhibitor,
psiCHECK2-SP1
-m-3
'UTR
和
miR-7
inhibitor
及各自阴
性对照
mimics-NC
,
通过
Lipofectamine
2000
进行瞬时
转染
MKN45
细胞
,37
益培养
,6
h
后更换细胞培养液
,
培养
48
h
后取出
，
用
PBS
洗涤
3
次
，
每孔加入
1
ml
总
RNA
裂解液
，
置摇床震荡充分裂解后
,
离心吸取上清
裂解液提取总
RNA
并测定浓度后
，
置
-80
益冻存
备用
。
1.2.7
双荧光素酶报告基因活性检测
转染
48
h
后
,
按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行操
作
，
最后利用
Synergy
H4
多功能酶标仪读取荧光值并
计算相对荧光活性
。
1.
2.
8
RT-PCR
检测
SP1
和
miR-7
的表达变化
提
取待分析细胞的总
RNA
和
microRNA
后
，
分别采用逆
转录试剂盒进行反转
，
反转条件为
42
益
15
min,85
益
5
min
后置
-20
益保存备用
。
按照
UltraSYBR
Mixture
试剂盒说明书进行实验
，
采用
2
-
驻驻
CT
方法计算目的基
因的倍性变化
。
每个实验组设
3
个平行
，
重复
3
次实
验并记录实验结果
。
软件进行统计处理
。
每组实验重复
3
次
,
结果以
x±s
表示
。
统计分析采用单因素方差分析或
t
检验,
P
<
0.
05
为差异具有统计学意义
。
2
结果
2.
1
microRNA7
靶基
因预测
使用
Targetscan
、
miRDB
和
Cytoscape
软件对
miR-7
的靶基因进行预
测
。
Targetscan
的标准是
Contest+<-0.
4,
miRDB
的标
准是
>80
。
将两个数据库的预测结果进行交叉
，
得到
46
个目标基因
。
利用在线数据库
（
https
：
//string-
db.
org/
）
Cytoscape
软件
（
version
11.0
）
进行可视化
,
建立包括蛋白质和基因在内的众多生物分子之间的
相互作用网络
（
图
1A
）
。
发现
miR-7
与
SP1
的
3'UTR
区有潜在结合位点
（
图
1B
）
o
2.
2
荧光素酶报告载体
psiCHECK2-SP1-w-3'UTR
的
鉴定
以提取的
GES-1
细胞基因组为模板
,
PCR
扩增
SP1-3'UTR
目的片段
,1.5%
琼脂糖凝胶电泳显示扩
增出的片段大小约为
220
bp,
大小与预期相符
（
图
2A
）
o
采用凝胶回收试剂盒回收扩增产物与载体
psi-
miR-7-5p:
3
'
-
ACCUUCUGUCGUCAUGGUUUCAG
-5'
IIIIIII
spl
・
w$UTR:
5
,
-...3
'
spl-m
・
3'UTR:
5'-...
3'
图
1
miR-7
靶基因预测网络图及与
SP1
3'-UTR
序列配
对分析
Fig.
1
miR-7
target
gene
prediction
website
and
sequence
pairing
analysis
of
SP1
3'-UTR
Note
:
A.
miR-7
target
gene
prediction
website
；
B.
Sequence
pairing
analysis
of
SP1
3
'-UTR
with
miR-7.
刘文莉等
miRNA-7
靶向
SP1
的
3'UTR
双荧光素酶报告基因载体构建及评价
第
1
期
-
75
-
图
2
psiCHECK2-SP1-w-3
忆
UTR
的质粒构建及酶切验证
Fig.
2
Construction
of
psiCHECK2-SP1-w-3'UTR
and
validation
by
enzyme
digestion
Note
：
A.
Agar
gel
electrophoresis
of
SP1-3'UTR
product
by
PCR
；
B.
Agar
gel
electrophoresis
of
constructed
wild
plasmid
verified
by
enzyme
digestion.
M1.
DL2000
marker
；
M2.
50
bp
ladder
；
1. Target
fragment
;2,3.
Verified
by
restriction
endonuclease
with
two
en-
zymes.
图
3
psiCHECK2-SP1-m3
忆
UTR
的质粒构建及鉴定
Fig.
3
Construction
of
psiCHECK2-SP1-m3'UTR
and
validation
by
enzyme
digestion
Note
：
A.
Agar
gel
electrophoresis
of
SP1-3'UTR
product
by
PCR
；
B.
Agar
gel
electrophoresis
of
constructed
wild
plasmid
verified
by
enzyme
digestion
；
C.
Comparison
of
wild
and
modified
3
'
UTR
se
quences.
M1.
DL2000
marker
；
1.
Target
fragment
F1
；
2.
Target
fragment
F2
；
3.
Fusion
fragment
；
4.
Verified
by
restriction
endonuclease
with
two
enzymes.
CHECK2
连接
，
转化感受态受体菌
DH5a,
经氨卞抗性
筛选挑取单菌落
,
经
PCR
鉴定
,
挑选鉴定正确的菌落
摇菌
，
抽提质粒
，
经
Xho
I
和
Not
I
双酶切后验证
，
在
220
bp
处可见酶切片段
,
与预期
SP1
片段大小相符
（
图
2B
）
。
初步证实目的基因已经插入到质粒载体
中
。
重组质粒测序结果表明
，
目的基因成功克隆入载
体
,
并且其序列与
GeneBank
中公布的一致
。
2
・
3
双荧光素酶报告质粒
psiCHECK2-SP1-m-3'
UTR
的鉴定
以
2.2
中构建成功的荧光素酶报告
载体
psiCHECK2-SP1-w-3'UTR
为模板
。
融合
PCR
技术依次扩增片段
F1
,F2
和
F3
（
图
3A
、
B
）
。
经酶切
及测序鉴定
F3
片段含有与
miR-7
结合的
4
个碱基
突变位点
,
由
TTCC
突变为
AAGG（
图
3C
）
。
2.
4
双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验
图
4
双荧光素酶活性分析野生型与突变型
psiCHECK2-
SP1-3
忆
UTR在胃癌
MKN45
细胞表达情况
Fig.
4
Analysis
of
dual
relative
luciferase
activity
of
psi-
CHECK2-SP1-w-3'UTR
and
psiCHECK2-SP1-m-
3'UTR
in
gastric
cancer
MKN45
cells
Note
:
Compared
with
the
w-3
'
UTR
+
NC
,
Rluc/Luc
of
the
w-3
'
UTR
+
miR-7
,
***
.
P
<0.
001
；
Compared
with
the
m-3'UTR
+
NC,
Rluc/
Luc
of
the
m-3
'UTR+miR-7
,
ns.
P
>0.
05.
图
5
miR-7
模拟物及抑制剂对
MKN45
细胞中miR-7
的
表达影响
Fig.
5
Expression
change
of
miR-7
in
miR-7
mimic
and
inhibitor
transfected
MKN45
cells
Note
：
A.
Compared
with
the
miR-7-NC
,
expression
of
miR-7
in
the
w-3
'
UTR
+
miR-7-mimic
,
***
.
P
<0.
001
；
B.
Compared
with
the
miR-
7-NC,
expression
of
miR-7
in
the
w-3
'UTR+miR-7
-
inhibitor
,
***
.
P
<0.
001.
结果显示
，
与阴性对照
mimics-NC
相比
，
转染
miR-7-5p
能显著降低转染
psiCHECK2-SP1-w-3'UTR
的
MKN45
细胞的相对荧光活性比值
(Rluc/Luc)
(
P<0.
001)
，
而对
转染
psiCHECK2-SP1
-m-3
'UTR
的
MKN45
细胞的
Rluc/
Luc
未有明显改变
(
P>0.
05)(
图
4)
。
2.5
miR-7
在胃癌细胞中负调控
SP1
的表达
miR-7
mimic
及
miR-7
inhibitor
转染胃癌
MKN45
细
胞
，
经
48
h
培养提取细胞总
RNA
、
microRNA
和总蛋
白
，
分别通过
qRT-PCR
和
Western
blot
检测
SP1
的
表达变化
。
结果发现,与转染阴性对照相比
，
转染
miR-7
mimic
促使
miR-7
过表达
(
图
5A)
,
同时在
mRNA
水平和蛋白质水平抑制细胞内
SP1
的表达
(
P
<0.
001),
而转染
miR-7
inhibitor
则抑制内源性
miR-7
的表达
(
图
5B),
同时促进
SP1
的表达
(
P
<
0.
001)
(
图
6
和图
7)
。
-
76
-
中国免疫学杂志
2021
年第
37
卷
或不表达的胃癌患者
［
9
］。
SP1
可以与
Smad
蛋白形
成化合物
，
从而诱导
Smad7
的转录和过表达
，
并负
向调节
TGF-
茁途径
,
从而影响胃癌细胞的生长
、
分
化和凋亡
［
⑹
。
SP1
的异常激活还可以上调肿瘤相
关因子和血管生成因子的表达
，
从而为肿瘤生长提
图
6
miR-7
模拟物及抑制剂对
MKN45
细胞
SP1-mRNA
的表达影响
供良好的微环境
,
并促进胃和胰腺肿瘤的增殖
、
转移
和血管生成
〔
⑴
。
SP1
被血管内皮生长因子的启动
Fig.
6
Expression
of
mRNA-SP1
of
miR-7
mimic
and
inhibitor
in
gastric
cancer
MKN45
cells
Note
：
A.
Compared
with
the
miR-7-NC,
expression
of
SP1
-mRNA
in
the
子募集
，
因其表达上调
，
促进了血管内皮的增殖
、
血
管生成并增加了血管的通透性
,
从而促进了肿瘤的
生长和转移
。
已经发现
SP1
表达的增加与胃癌患者
w-3'UTR
+
miR-7-mimic
,
***.
P
<0.
001
；
B.
Compared
with
the
miR-7
-NC
,
expression
of
SP1
-mRNA
in
the
w-3
'
UTR
+
miR-7
-
inhibitor,***.
P<0.
001.
SP1
GAPDH
NC
miR-7
mimic
图
7
miR-7
模拟物及抑制剂对
MKN45
细胞中
SP1蛋白
的表达影响
Fig.
7
Expression
of
SP1
protein
of
miR-7
mimic
and
inhibitor
in
gastric
cancer
MKN45
cells
Note
：
A.
Compared
with
the
miR-7-NC,
SP1
protein
in
the
w-3
'
UTR
+
miR-7
mimic,
***
.
P
<0.
001
；
B.
Compared
with
the
miR-7-NC
,
SP1
protein
in
the
w-3
'UTR+miR-7
inhibitor
,
***.
P
<0.
001.
3
讨论
正常情况下
,SP1
在体内各种细胞中广泛表达
并受机体的严格调控
,
具有高度保守序列
，
通过直接
与启动子结合调节基因的表达⑺
,
目前
SP1
已被公
认为是促癌蛋白
，
在调控肿瘤细胞增殖和凋亡过程
中发挥重要作用
。
已在多种肿瘤类型中得到证实,
在胃癌
、
胰腺癌和乳腺癌等癌症中则表现为高表达
,
且其表达水平与肿瘤的分级和分期
、
侵袭和转移能
力及患者的生存期和不良预后密切相关
，
如同一胃
癌患者的胃癌组织中
SP1
的表达水平显著高于周围
正常组织
，
且与肿瘤的浸润程度呈正相关⑻
；
SP1
高
表达的胃癌患者的中位生存期显著低于
SP1
低表达
预后的恶化程度呈正相关
〔
⑵
。
同样
,miR-7
发挥抑
癌基因的作用
,
miR-7
在胃癌细胞中表达低下
，
可通
过靶向胰岛素样生长因子受体
1
抑制胃癌细胞的转
移
〔
⑶
。
谭海洋等
［
14
］
报道
miR-7
上调可抑制胃癌细
胞增殖
，
促进细胞凋亡
。
当
microRNA
与
mRNA
存
在互补配对时
,
降解
mRNA
合成新生多肽链
,
抑制
其翻译
，
从而调节细胞的增殖
、
分化
、
凋亡及肿瘤的
形成和转移等一系列的重要生物学过程
［
⑸
。
本实验通过生物信息学方法预测
miR-7
的潜在
靶基因
，
依据算法对
miR-7
靶分子的样本群进行评
分
,Targetscan
的标准是
Contest+<-0.
4
,
miRDB
的标
准是
>80,
通过基因重组和
PCR
技术在胃癌细胞中
瞬时转染
miR-7,
分别从
mRNA
和蛋白质水平验证
了
miR-7
对胃癌细胞负调控
SP1
的表达情况
。
在本研究中
，
对胃癌细胞
MKN45
共转染
miR-7
模拟物和抑制剂
，
miR-7
可以在
mRNA
和蛋白质水
平抑制细胞内
SP1
的表达
，
而转染
miR-7
抑制剂后
则逆转对
SP1
的抑制作用
。
发现
miR-7
可能是胃癌
细胞中负性调控
SP1
活性的重要反馈调控机制
，
并
初步构建
psiCHECK2-SP1
3'UTR
荧光素酶报告载
体
,
通过双荧光素酶报告实验对
miR-7
负调控
SP1
的功能进行验证
，
以验证
miR-7
通过调控
SP1
参与
胃癌发生发展的潜在机制
。
本实验扩增出长度为
220
bp
的
SP1
3'UTR
基
因序列
,
并将其连入荧光素酶报告载体
,
成功构建了
pisCHECK2-SP1
3'UTR
表达载体
。
miR-7
可能通过
作用于
SP1
的
3'UTR
区域对该基因进行靶向调控
,
实现对胃癌细胞发生发展的调节
。
关于
miR-7
通过
调控
SP1
参与胃癌发展的信号传导机制
，
本课题组
将会在后续研究中不断探索
。
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收稿
2020-06-28
修回
2020-07-30]
(
编辑倪鹏
)
2013,30(4)
：
1782-92.
DOI
：
10.3892/or,2013.2627.
•
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