2024年4月19日发(作者：)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.9
(22)申请日 2013.01.25
(71)申请人 海尔施生物医药股份有限公司
地址 315800 浙江省宁波市小港街道前进村半港河西159号
(72)发明人 南丽 颜进 王晴晴 吴勇
(74)专利代理机构
代理人
(51)
C12Q1/68
权利要求说明书 说明书 幅图
(10)申请公布号 CN 103074436 A
(43)申请公布日 2013.05.01
(54)发明名称
一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基
因检测试剂盒及其检测方法
(57)摘要
本发明公开了一种指导5-氟尿嘧啶
用药的多重基因检测试剂盒及其检测方
法，包括超纯水，X溶液，10×PCR缓冲
液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA
聚合酶和阳性对照品，特点是PCR引物包
括以下6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上
的7个SNP位点上的不同基因型的正反向
扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及
反应内参的正反向扩增引物，其基因序列
如SEQ ID NO.1～NO.32所示；其检测包
括采集样本并提取核酸的步骤；以提取的
核酸为模板进行PCR反应的步骤；最后
GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品的步
骤，优点是特异性强、准确度高、通量
高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
1.一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒，包括超纯水，X溶液，
10×PCR 缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶
PCR引物包括以下6个与
和阳性对照品，其特征在于所述的
5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正
反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，
如下： 其核酸序列
2.根据权利要求1所述的一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒，其特征
在于：所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的
物序列为AGGTGACACTATAGAATA；
通用引物正向扩增引
反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通
用引物正向扩增引物带荧光标记。
3.根据权利要求1所述的一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒，其特征
在于：所述的阳性对照品为上述6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上
同基因型的引物克隆所得DNA片段。 的7个SNP位点上的不
4.一种利用权利要求1-3中任一项所述的指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂
盒的检测方法，其特征在于具体包括以下
步骤：
（1）采集样本并提取核酸
采集肿瘤患者口腔拭子或血液样品，从中提取核酸；
（2）以提取的核酸为模板进行PCR反应
取DNA样品2μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁3.4μL，PCR引物溶液2
μL，DNA聚合酶0.6μL，X溶液2μL，超纯水10μL混匀后加入到96
反应，反应条件：95°C1分钟；94°C30
次；70°C1分钟；
孔样品板上进行PCR
秒钟，60°C30秒钟，70°C1分钟，循环35
4°C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸
和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为
序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物
GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记；PCR
引物溶 液中各PCR引物浓度均为200nM，所述的PCR引物包
基因上的7个SNP位点上
括以下6个与5-氟尿嘧啶用药相关
的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物
及反应内参的正反向扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1～NO.32
所示；
（3）GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
取PCR产物0.1-1μL，Beckman GeXP系统配套的上样缓冲液38.75μL，DNA标准
品0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细
GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱
因的SNP位点的等位基因
电泳分离样品，将
对比，获得指导5-氟尿嘧啶用药相关基
型。
说 明 书
技术领域
本发明涉及多重基因检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种指导5-氟尿嘧啶
用
背景技术
5-FU类药物属抗代谢类化疗药中的氟尿嘧啶类,这些药物在体内均转化为5-FU，抑
制脱氧胸苷酸合成酶,从而影响DNA的合成，达到抑制肿瘤的生长的目的。
物的使用不可避免地损伤患者体内正常的细胞分裂，出现诸多
物的抗癌谱很广，是使用最为广泛的抗肿瘤药物
却存在治疗有效率低和副作用大的
分患者耐药并出现严
性
药的多重基因检测试剂盒及其检测方法。
因此该类药
的化疗副作用。5-FU类药
之一。但在5-FU类药物的临床应用中，
问题，而且存在显著的个体差异，部分患者获益，部
重毒副作用。研究表明，人群对5-FU的个体差异与单核苷酸多态
（SNP）密切相关。肿瘤患者在接受5-FU类药物化疗之前，进行5-FU类药物相关
SNP 基因位点的监测，根据监测结果制定化疗方案，提高肿瘤临床治疗的
毒副作用的发生，节约宝贵的医治时间。 针对性，减少药物
现有的指导5-氟尿嘧啶用药的单核苷酸多态性（SNP）诊断方法主要为基因芯片法、
（1）qPCR检测方法：采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点变异设计
特 异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强。其缺点是（1）通量低：
点的检测；难以设置内控基因。(2)成本较高：探针标
信息，需进行多个检测试验，叠加
荧光定量PCR（qPCR）和Sanger测序法。
不适宜多SNP位
记成本高；若需获得所有相关SNP
成本更加昂贵。
(2)基因芯片法：基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定
序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物
一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进
表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。
上，构成的
行杂交，可对样品的基因
DNA芯片：由于高通量等优点在SNP检测中
得到大量应用，依靠野生型与突变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行
点是：（1）高通量并行检测；（2）操作简便快速：整个检测
果。缺点：1）不同SNP位点之间的杂交动力学
件难以控制；2）技术成本昂贵、
不利于大规模
检测。其优
只需4-8小时基本可以出结
差异不同，在进行多位点同时检测时条
复杂：每个样品需要一个芯片，成本大于￥1000/样品，
推广；探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是
主要的限速步骤；3）重复性差，准确性低，易出现假阳性假阴性结果；4）
低：芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于
聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而
灵敏度；5）由于芯片的种
灵敏度较
引物较多，容易自身产生二
导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的
类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。
（3）Sanger（双脱氧链终止法）测序法：Sanger法是根据核苷酸在某一固定的
点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标
生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然
电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱
SNP，也能发现未知
记，产
后在尿素变性的PAGE胶上
基序列。其优点是SNP分析金标准，能发现已知
SNP。缺点是每个样本的每个位点均需要经PCR扩增，跑胶，然后切
胶纯化，再测序。步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，多个
计价格相对昂贵。 SNP位点检测累
GenomeLabTMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟
的毛细管电泳分 离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束
8道的毛细管陈列设计充分利用 了96孔板的排列特性，降低了使用更大
法，通过Beckman Coulter
快速有效地检
的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方
染色标记，在同一个EP管中同时分析多个基因的表达，能
测基因的表达状况，克服了上述方法存在的缺陷，具有以下优点：
1、高通量：本系统采用双（96孔）板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应
检测30-40个位点，可同时做192个反应（如192个患者样品，每个样品检
泻病毒，30个位点），一天出结果；对于交叉感染患者，本
避免漏检。
测30种腹
方法可一次性给出准确报告，
2、准确性强：GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩
增
3、敏感性高，结果重复性好：GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增
造 成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性，采用激
具有超高灵敏度；
产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；
光诱导荧光-PMT，
4、方法简便，使用经济：GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表
达 谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模
推广；
5、精确定量、灵活性强：可精确定量病原体基因拷贝数，可随时根据需求调整检
6、易于实现自动化：就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP
分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样
果报告。
测的靶基因。
品追踪和结
目前，国内外还没有关于基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导5-氟尿嘧啶
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、
成本低、无假阴性结果的基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指
的多重基因检测试剂盒及其检测方法。
用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法的相关研究报道。
导5-氟尿嘧啶用药
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重
基 因检测试剂盒，包括超纯水（ddH2O），X溶液，
化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对
关基因上的7
10×PCR缓冲液，PCR引物，25mM氯
照品，所述的PCR引物包括以下6个与5-氟尿嘧啶用药相
个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物
表1
上述XPD基因上rs1318片段的A型基因的反向扩增引物与C型基因的反向扩增引
物均 采用核酸序列SEQ ID NO.3：AGGAACCGTTTATGGCCC；上述
型基因的正向扩增引物与T型基因的正
及反应内参的正反向扩增引物，其核酸序列如下表1所示：
DPYD基因上rs1801265片段的C
向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.4：
CTTACAAAGCAGTTCTTATCAGGATTT；DPYD基因上rs3918290片段的
与T型基因的反向扩增引物均采用核酸序列C型基因的反向扩增引物
SEQ ID NO.9：CTCATCAGTGAGAAAACGGCT；上 述MTHFR基因上
rs1801133片段的G型基因的正向扩增引物与A型基因的正向扩增引物均
采用核酸序列SEQ ID NO.10：ACCCTCGCCTTGAACAGGTGG；上述
的G型基因的反向扩增引物与C型基因OPRT基因上rs1801019片段
的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.15：
AGCATCTGCTAGCTGCAACA；上述NOS3基因上rs1799983片段的G型
型基因的正向扩增引物均采用核酸序列
GSTP1基因上
基因的正向扩增引物与T
SEQ ID NO.16：TCTTGAGAGGCTCAGGGATG；上述
rs1695片段的A型基因的反向扩增引物与G型基因的反向扩增引物均采用核
所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正
向 扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为
述的通用引物正向扩增引物带荧光
酸序列SEQ ID NO.21：CAAGCCACCTGAGGGGTA。
GTACGACTCACTATAGGGA，所
标记。
所述的阳性对照品为上述6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的
不同
一种使用指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒的检测方法，其特征在于具
体
（1）采集样本并提取核酸
采集肿瘤患者口腔拭子或血液样品，从中提取核酸；
（2）以提取的核酸为模板进行PCR反应
包括以下步骤：
基因型的引物克隆所得DNA片段。
取DNA样品2μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁3.4μL，PCR引物溶液2
μL，DNA聚合酶0.6μL，X溶液2μL，超纯水10μL混匀后加入到96孔样
反应，反应条件：95°C1分钟；94°C30秒钟，60°C30
次；70°C1分
品板上进行PCR
秒钟，70°C1分钟，循环35
钟；4°C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸
（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为
向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反
GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记；
PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，所述的PCR引物包括以下6
啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的
向扩增引物及反应内参的正反向扩
所示；
个与5-氟尿嘧
正反向扩增引物、DNA内参的正反
增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1～NO.32
（3）GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
取PCR产物0.1-1μL，Beckman GeXP系统配套的上样缓冲液38.75μL，DNA标准
品0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分
GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，获得指
因的SNP位点的等位基因型。。
离样品，将
导5-氟尿嘧啶用药相关基
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基
因 检测试剂盒及其检测方法，本试剂盒及检测方法基于多重PCR和毛
同长度的PCR特异性扩增片段来鉴定区分不同
MTHFR、OPRT、NOS3和
指导
细电泳技术，利用不
的基因，创立了一种同步检测XPD、DPYD、
GSTP1六个基因的7个SNP位点上的不同基因型的检测方案，以
5-FU的临床用药，本方法优化多重PCR反应体系，对待测DNA样品进行特异性
扩 增，再用毛细电泳方法分离PCR扩增产物以鉴别不同的基因和基因
成192个患者样品的检测，既节约了生产成本和型，其一天之内可完
检测成本，又提高了检测效率及缩短了 时间；DNA内参基因的使用可用
阴性；反应内
于监测整个反应系统以及评估DNA模板的质量，避免假
参的使用可用于监测整个反应系统、PCR反应的效率，避免假阴性。
综上所述，本发明基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导5-氟尿嘧啶用药的
多重基因检测试剂盒及其检测方法，同步对6个与5-氟尿嘧啶用药相关基
SNP位点上的不同基因型进行检测，检测敏感性高，特异性
假阳性率，还能够有效解决常规PCR的
强，无假阴性结果，
势，为
因上的7个
好，降低了常规PCR扩增的
易污染问题；具有非竞争性内对照体系，可靠性
利用GeXP遗传分析系统灵敏、准确定量、快速、高通量的技术优
临床提供一种优越的低成本的分子诊断方法，有助于化疗药物安全有效地使用。
附图说明
图1为GeXP遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果标准图谱。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
本发明一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测试剂盒，该试剂盒中包括以下试
1)PCR引物（PCR Primer Mix）
2)25mM氯化镁（MgCl2）
3)DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase）
剂：
4)X溶液（Solution X）
5)PCR缓冲液（PCR Buffer）
6)阳性对照（Positive Control）
7)超纯水（ddH2O）
上述PCR引物包括以下6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不
同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正
其基因序列如表1所示（也可参见序列表）：
反向扩增引物，
表15-氟尿嘧啶用药指导多重基因检测寡核苷酸序列
上述XPD基因上rs1318片段的A型基因的反向扩增引物与C型基因的反向扩增引
物均 采用核酸序列SEQ ID NO.3：AGGAACCGTTTATGGCCC；上述
型基因的正向扩增引物与T型基因的正DPYD基因上rs1801265片段的C
向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.4：
CTTACAAAGCAGTTCTTATCAGGATTT；DPYD基因上rs3918290片段的
与T型基因的反向扩增引物均采用核酸序列
述MTHFR基因上
C型基因的反向扩增引物
SEQ ID NO.9：CTCATCAGTGAGAAAACGGCT；上
rs1801133片段的G型基因的正向扩增引物与A型基因的正向扩增引物均
采用核酸序列SEQ ID NO.10：ACCCTCGCCTTGAACAGGTGG；上述
的G型基因的反向扩增引物与C型基因OPRT基因上rs1801019片段
的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.15：
AGCATCTGCTAGCTGCAACA；上述NOS3基因上rs1799983片段的G型
型基因的正向扩增引物均采用核酸序列
GSTP1基因上
基因的正向扩增引物与T
SEQ ID NO.16：TCTTGAGAGGCTCAGGGATG；上述
rs1695片段的A型基因的反向扩增引物与G型基因的反向扩增引物均采用核
上述试剂盒可同步对6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不同
基因 型进行检测，利用不同长度的PCR特异性扩增片段来鉴定区分SNP
指导5-氟尿嘧啶的临床用药，具体如表2所示：
酸序列SEQ ID NO.21：CAAGCCACCTGAGGGGTA。
位点的等位基因型，以
表2.5-FU用药指导多重基因检测检测靶标位点
上述X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向
扩 增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为
的通用引物正向扩增引物带荧光标GTACGACTCACTATAGGGA，所述
记。
上述阳性对照品为上述6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位点上的不
同基 因型的引物克隆所得DNA片段（阳性对照品由本试剂盒各靶基因核
片段）。 苷酸引物克隆所得DNA
上述试剂盒设置了一个针对人DNA的内参，用于监测DNA样品的质量；同时设
置了 一个以质粒pcDNA3.1为模板的反应内参，用于监测PCR反应的正
常进行（表1）。
具体实施例二
本发明一种指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因检测方法，采集患者肿瘤组织提取核
酸，以肿瘤患者核酸为模板进PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，
具体步骤如下：
1、生产基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导5-氟尿嘧啶用药的多重基因
检
2、采集样本并提取核酸
采集肿瘤患者口腔拭子或血液样品的分离培养物，从分离培养物中提取核酸；
3、以提取的患者核酸为模板进行PCR反应
1）按以下比例在96孔样品板/八连管上加入试剂和样品（PCR板见表3），并设
置
表3PCR反应试剂和样品混合比例
注：由本试剂盒各靶基因核苷酸引物克隆所得DNA片段，用量为1μL/反应；
一个阳性对照反应：
测试剂盒，试剂盒中包括的组分同上述实施例1；
X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，通用引物正向扩增引物序
列为 AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为
引物带荧光标记。阳
SNP
GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向扩增
性对照品为实施例1中6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个
位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段
2）混匀后按以下温度进行热循环反应（见表4）：
表4PCR反应条件
4、GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品 1）制备GeXP样品（见表5）：
表5GeXP样品混合比例
（Beckman GeXP系统配套试剂） 2）毛细电泳分离样品
将GeXP样品加入96孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中；毛细管电泳分离是
一 类以毛细管为分离通道、以高压直流电场
℃变性120秒，进样电压为驱动力的新型液相分离技术，具体程序为90
2kv，30秒，分离电压6kv，35分钟。
5、结果分析（见GenomeLab GeXP遗传分析仪说明书）
根据GeXP遗传分析仪自有软件上默认的参数对结果进行片段大小分析，其横坐标
表示片段大小，纵坐标为信号强弱。将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱
对比，获得6个与5-氟尿嘧啶用药相关基因上的7个SNP位
5-氟尿嘧啶的临床用药。标准图谱如图1所示，
用药相关基因上的7个SNP位点
至于过饱和，
与标准图谱
点的等位基因型，以指导
其结果能准确检测出6个与5-氟尿嘧啶
上的等位基因型，各目标片段大小间隔适中，且信号不
各靶标间信号相对持平，且没有宽峰、双峰等现象。
具体实施例三
检测试剂盒特异性分析：单重PCR扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技
术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也
护范围。
应属于本发明的保
发布评论