2024年4月20日发(作者：)

－－——

５４—－——　江苏农业科学２０１２年第４０卷第４期　

王文涛，鑫淼，张冬杰，等．　￡曰基因在３６０日龄野家杂交猪不同组织中的表达［Ｊ］．江苏农业科学，２０１２，４０（４）：５４—５５　

Ｃｓｔ　Ｂ基因在３６０日龄野家杂交猪不同组织中的表达　

王文涛，鑫淼，张冬杰，刘娣　

（黑龙江省农业科学院畜牧研究所，黑龙江哈尔滨１５００８６）　

摘要：采用ＲＴ—ＰＣＲ技术，对Ｃｓｔ　Ｂ基因在３６０日龄野家杂交猪心肌、肝脏、胃、肾脏、肺、大肠、小肠、背肌和腿肌　

等组织中的表达情况进行了分析研究。结果表明，Ｃｓｔ　Ｂ基因在３６０日龄野家杂交猪小肠中有较高的表达，在其他组　

织中的表达量相对较低。　

关键词：猪；ＲＴ—ＰＣＲ；Ｃｓｔ　Ｂ基因；组织表达　

中图分类号：Ｑ７８６　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—１３０２（２０１２）０４—０ｏ５４－０２　

Ｃｓｔ　Ｂ是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族Ｉ（ｃｙｓｔａｔｉｎ）成员之　

一

…

，

ｃｙｓｔａｔｉｎ是溶酶体半胱氨酸蛋白酶（如组织蛋白酶Ｂ、Ｈ、　

１材料与方法　

１．１材料　

Ｌ和Ｓ等）的内源性抑制剂，由一个大的超家族组成，包括Ａ、　

Ｂ、Ｃ等数种　Ｊ。Ｃｙｓｔａｔｉｎ　Ｂ（又称ｓｔｅｉｆｎ　Ｂ，ＳＴＦＢ）主要抑制组　

织蛋白酶Ｌ，通过控制细胞内溶酶体蛋白酶的活性从而调控　

ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＩ２０００、４种脱氧核苷酸（ｄＮＴＰ）、ｒＴａｑ　ＤＮＡ　

聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖（Ａｇａｍｓｅ，西班　

牙）；ＴＲＩＺＯＬ　Ｒｅａｇｅｎｔ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；引物合成和ＰＣＲ　

蛋白转换和酶原、激素原的加工　。Ｃｓｔ　Ｂ基因在人类中已经　

得到全序列，含有３个外显子、２个内含子，Ｃｄｓ全长２９７　ｂｐ，３　

个外显子的长度分别为６６、１０２、１２９　ｂｐ　。Ｃｓｔ　Ｂ基因在猪上　

产物克隆测序由上海英俊生物技术有限公司完成。供试样本　

采自黑龙江省伊春市爱林林场（３６０日龄野家杂交猪）。　

１．２方法　

的研究获得了全Ｃｄｓ序列，其中３个外显子长度分别为６６、　

９９、１０２　ｂｐ。　

取３６０日龄野家杂交猪各个组织样品，ＴＲＩｚｏｌ法提取总　

ＲＮＡ，２％琼脂糖电泳验证ＲＮＡ的完整性，并用光密度读取　

Ｄ　与Ｄ　。　，检测ＲＮＡ质量，计算ＲＮＡ浓度。　

野猪又名山猪，是偶蹄目猪科猪属之一。野猪膘肥体壮，　

四肢粗短，头部较长，耳小并直立，吻部突出似圆锥体，它的顶　

端为裸露的软骨垫（拱鼻）；每脚有四趾，俱为硬蹄，仅中间两　

趾着地；尾细短；犬齿发达，雄性上犬齿外露，并向上翻转，呈　

獠牙状；野猪耳披有刚硬而稀疏的针毛，背脊鬃毛较长而硬；　

根据ＧｅｎＢａｎｋ上提供的序列设计引物（表１）。ＰＣＲ反应　

条件如表２。　

对３６０日龄野家杂交猪的心肌、肝脏、胃、肾脏、肺、大肠、　

小肠、背肌和腿肌组织的Ｃｓｔ　Ｂ和口一ａｃｔｉｎ基因的表达量进行　

整个体色棕褐或灰黑色，因地区而略有差异。野家杂交猪是　

用野猪与家猪进行杂交所产的杂交猪及其所产的后代。本研　

究利用ＲＴ—ＰＣＲ技术，对Ｃｓｔ　Ｂ基因在３６０日龄野家杂交猪　

的心肌、肝脏、胃、肾脏、肺、大肠、小肠、背肌和腿肌组织中表　

达情况进行研究，表现为Ｃｓｔ　Ｂ基因在不同组织中的表达　

差异　。　

收稿日期：２０１１—０８一Ｏ１　

基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（编号：ＣＡＲＳ一３６）　

作者简介：王文涛（１９８１一），男，硕士研究生，研究方向为动物遗传育　

种与繁殖。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｗｅｎｔａｏ＿１９８１＠１６３．ｃｏｒｎ。　

通信作者：刘娣，女，教授，博士生导师，研究方向为分子生物学。　

Ｔｅｌ：（ｏ４５１）８７５０２３３０。　

了分析。为了确定扩增循环数没有进入平台期，首先利用反　

转录反应的产物为模板进行ＰＣＲ线性增长试验，即在其他条　

件相同的情况下，ＰＣＲ反应循环数设为不同的值。反应结束　

后在相同的琼脂糖凝胶上电泳，根据凝胶图像分析结果，以循　

环数为横坐标，积分光密度（ＩＯＤ）的对数值（１ｇｌＯＤ）为纵坐　

标，用Ｅｘｃｅｌ软件绘制ＰＣＲ产物增长的折线图。根据检测结　

果确定反应的循环数。　

采用１％琼脂糖凝胶电泳，分别取口一ａｃｔｉｎ基因和Ｃｓｔ　Ｂ　

基因的ＰＣＲ产物各５　电泳，　曰基因和卢一ａｃｔｉｎ基因的　

ＰＣＲ产物点在同一块胶上。电泳结束后用Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司的　

Ｑｕａｎｔｉｔｙ—Ｏｎｅ软件以光密度吸收测定法进行目的基因表达　

的定量分析。　

ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｃａｔａｌａｓｅ　ｉｎ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘ　

ｐｒ　Ｐｕｒｉｆ，２００７，５４：２４—２９．　

（上接第５３页）　

［２］Ｆｏｙｅｒ　ＣＨ，Ｎｏｃｔｏｒ　Ｇ．Ｏｘｙｇｅｎ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｉｎ　ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　

ａｎｄ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｎｅｗ　Ｐｈｙｔｏｌ，２０００，１４６：３５９—３８８．　

［３］Ａｂｄｕｌｌａｈｉｌ　ＢＭ，Ｌｅｅ　ＥＪ，Ｐａｅｋ　ＫＹ．Ｍｅｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ　ｉｎｄｕｃｅｄ　

ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｇｒｏｗｔｈ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　ａｄ—　

［５］Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｌａｉ　ｃ，Ｗｕ　Ｑ，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｎｄ　ａｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏ’　

ｖｅｌ　ａｎｆｉｍｉｅｍｂｉａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ＨＫＡＢＦ　ｂｙ　Ｐｗｈｍ　ｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏ—　

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，４３：１１２４—１１３１．　

ｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｍｏｒｉｎｄａ　ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ：ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅｓ　

［６］李芳军．萝　过氧化物酶基因ＲｓＰｒｘｌ在酵母中的表达、纯化及鉴　

定［Ｄ］．新乡：河南师范大学，２０１０（５）：１１—２６．　

［７］Ｒｏｍａｎｏｓ　Ｍ　Ａ，Ｓｃｏｒｅｒ　Ｃ　Ａ，Ｃｌａｒｅ　Ｊ　Ｊ．Ｆｏｒｅｉｇｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　

ｙｅａｓｔ：ａ　ｅｖｉｒｅｗ［Ｊ］．Ｙｅａｓｔ，１９９２，８（６）：４２３—４８８．　

ａｎｄ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｍｍｏｎｉａ　ｌｙａｓｅ［Ｊ］．Ｐｌｎｔａ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ，２０１０，２９（７）：　

６８５—６９４．　

［４］Ｓｈｉ　ＸＬ，Ｆｅｎｇ　ＭＱ，Ｓｈｉ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｈｉｇｈ—ｌｅｖｅｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａ－　

王文涛等：　曰基因在３６０日龄野家杂交猪不同组织中的表达　一５５一　

舛环舛环　

℃　

℃　

ｎ　Ｏ　

℃　

℃　

ｎ　Ｏ　

表２　ＰＣＲ反应条件　

从图２可以看出，　￡日基因在３６０日龄野家杂种猪的小　

基因

Ｃｓｔ　Ｂ　

ＰＣＲ反应条件　

∞℃如℃　

℃寸－℃　．胁　舛．眦　

肠中有较高的表达，其他组织表达量相对较低。　

３讨论　

８一ａｃｔｉｎ　

℃　℃　

髋　畦　

半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员广泛分布在不同类型的　

细胞和组织中，并且被认为是最重要的体细胞组织蛋白酶抑　

如　如　

２结果与分析　

℃　℃　

２．１总ＲＮＡ的提取和检测　

∞　∞　

ＴＲＩｚｏｌ法提取的总ＲＮＡ在２％普通琼脂糖凝胶电泳结果　

见图１。图１中显示的３条带分别为２８Ｓ、１８Ｓ、

个　个　

５Ｓ，条带清晰　

明亮，表明ＲＮＡ提取成功。　

循　循　

图１　组织总ＲＮＡ电泳圈　

２．２循环参数的确定　

半定量ＲＴ—ＰＣＲ技术中，目的基因与内源对照的比较应　

该在ＰＣＲ扩增产物增长的对数生长期进行，为防止目的基因　

或　一ａｃｔｉｎ基因的ＰＣＲ扩增到达平台期，在进行基因表达定　

量前，首先应该分别建立目的基因与内源对照基因ＰＣＲ扩增　

循环参数，当循环数为２７次时，产量呈线性增加，因此，扩增　

各个组织中Ｃｓｔ　Ｂ基因采用２７个循环数即可。　

２．３　Ｃｓｔ　Ｂ基因在３６０日龄野家杂交猪各组织中的表达　

采用半定量ＲＴ—ＰＣＲ方法检测ＣｓｔＢ基因在３６０日龄野　

家杂交猪的心肌、肝脏、胃、肾脏、肺、大肠、小肠、背肌和腿肌　

组织中表达情况，结果见图２。　

ＣｓｔＢ　ｐ．ａｃｔｉｎ　

Ｏ．５　

０．４　

０．３　

。一２　

０．１　

０　

：几ｒ］厂１　ｒ］ｎ　ｒ］　厂］ｒ］　

心肝胃肾肺大肠小肠背肌腿肌　

器官　

图２　ＣｓｔＢ基因在各组织中的ＲＴ—ＰＣＲ结果　

制剂。干制火腿的极度松软与其加工过程中的高蛋白酶解水　

平有关，并表现出其他一些缺点，如黏性咀嚼、颜色发黑、有涩　

味和金属味、长期的酪氨酸结晶以及在切口表面形成的白色　

膜状物。在火腿的加工过程中，蛋白质的降解大部分都是由　

肌质和肌浆中的溶酶体蛋白酶催化的　，这些溶酶体蛋白酶　

的主要代表是组织蛋白酶Ｂ、Ｈ、Ｌ和Ｄ，这些酶在猪的成熟阶　

段都是有活力的，然而半胱氨酸蛋白酶抑制剂（ｃｙｓｔａｔｉｎｓ）可　

能降低这些酶的功能　。　

本研究发现在３６０日龄野家杂交猪肌肉组织中，Ｃｓｔ　Ｂ基　

因在背肌和腿肌中表达量相对较低，而背肌中的表达量显著　

高于腿肌的表达量。从蛋白酶水解的角度来说，利用３６０日　

龄野家杂交猪背肌和腿肌制作的火腿品质相对较低，而利用　

背肌制作的火腿品质高于腿肌制作的火腿。本研究结果为进　

一

步研究Ｃｓｔ　Ｂ基因与肉质的相关性、调控猪肌肉组织生长　

发育、猪屠宰后新鲜肌肉中蛋白酶活力和陈酿的火腿中蛋白　

酶解水平的关系等机理提供依据。　

参考文献　

［１］Ｂｒｚｉｎ　Ｊ，Ｔｒｓｔｅｎｊａｋ　Ｍ，Ｒｉｔｏｎｊａ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　

ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ［Ｍ］．Ｂｅｒｌｉｎ／Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ，１９８６：　

４＿４３—４５３．　

［２］Ｔｕｒｋ　Ｖ，Ｂｏｄｅ　Ｗ．Ｔｈｅ　ｃｙｓｔａｔｉｎｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ－　

８８ｅｓ［Ｊ］．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ，１９９１，２８５（２）：２１３．　

［３］Ｋａｔｕｎｕｍａ　Ｎ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｎａｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｙｓｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ［Ｊ］．　

Ｒｅｖｉｓ　Ｂｉｏｌ　Ｃｅｌｕｌａｒ，１９８９，２０：３５—６１．　

［４］Ｚｅｒｏｖｎｉｋ　Ｅ，Ｐｏｍｐｅ—Ｎｏｖａｋ　Ｍ，Ｓｋａｒａｂｏｔ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｈｕｍａｎ　ｓｔｅｆｉｎ　Ｂ　

ｅｒａｄｉｌｙ　ｆｏｒｍｓ　ａｍｙｌｏｉｄ　ｆｉｂｒｉｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ，　

２００２，１５９４（１）：１—５．　

［５］王文涛，何鑫淼，彭福刚，等．Ｃｓｔ　Ｂ基因在９０日龄大白猪不同组　

织中的表达研究［Ｊ］．华北农学报，２０１０，２５（增刊）：２５－２７．　

［６］Ｒｕｓｓｏ　Ｖ，Ｆｏｎｔａｎｅｓｉ　Ｌ，Ｄａｖｏｌｉ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　

ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　ｍｅａｔ　ｑｕａｌｉ￣ｉｎ　ｄｒｙ—ｃｕｒｅｄ　ｈａｍ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ　ｐｏｒｃｉｎｅ　ｃａ・　

ｈｔｅｐｓｉｎ　Ｂ（ＣＴＳＢ）ａｎｄ　ｃｙｓｔａｔｉｎ　Ｂ（ＣＳＴＢ）ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ａｎｉｍａｌ　Ｇｅｎｅｔ－　

ｉｃｓ，２００１，３３：１２３—１３１．　

［７］Ｌｅｎａｒｃｉｃ　Ｂ，Ｋｒｉｚ￣ｊ　Ｉ，Ｚｕｎｅｃ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　

ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｔｅｉｆｎｓ　Ａ，Ｂ　ａｎｄ　Ｄ　ｗｉｔｈ　ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ［Ｊ］．ＦＥＢＳ　

Ｌｅｔｔ，１９９６，３９５（２／３）：１１３—１１８．