2024年6月6日发(作者：)

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号

CN 109762780 A

(43)申请公布日

2019.05.17

(21)申请号 2.9

(22)申请日 2019.03.29

(71)申请人 北京昱龙摩尔国际生物医学研究院

地址 102200 北京市昌平区东小口镇天通

西苑三区26号楼-1至4层4-101门四层

413

(72)发明人 张晓南　吴芳春　吴刘兵　陈虎　

张斌　侍晓云　

(74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务

所(特殊普通合伙) 11419

代理人 王玉松

(51).

C12N

5/071

(2010.01)

权利要求书2页 说明书7页 附图1页

(54)发明名称

一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法

(57)摘要

本发明提供了一种人肺泡上皮细胞分离与

培养方法，采集的组织在活化基底的包围下可以

有效地进行贴壁生长，血清成分可抑制肺泡上皮

细胞的分裂和分化，从而大大提高了细胞活力；

组织碎片在特定的气体环境下震荡培养，可以有

效避免采集的组织样本由于缺血而引起损伤，以

利于后续的培养操作；传代培养基中添加的尿囊

素、肌酸和积雪草苷可以有效提高细胞活力和分

裂能力，从而促进细胞生长和增殖；将3T3细胞作

为滋养层，可以为原代肺泡上皮细胞提供良好的

生长基底，有效促进肺泡上皮细胞的生长分裂，

从而大大提高培养效果。通过上述方法，可以显

著提高肺泡上皮细胞的活性和增值速率，从而为

相关研究项目提供优质的实验材料。

C

N

1

0

9

7

6

2

7

8

0

A

CN 109762780 A

权　利　要　求　书

1/2页

1.一种人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：在无菌条件下采集肺叶样本，将气管切成片状组织，得到肺泡上皮组织的组织碎

片；

S2：配置用于细胞贴壁生长的活化基底，涂布在培养皿上并进行固化；

S3：在固化的所述活化基底上设置接种位置，并将所述组织碎片接种到所述接种位置

上，使所述组织碎块贴附在培养皿底壁；

S4：向接种后的组织碎片中添加活化培养液，置于混合氧气内进行活化培养；

S5：将经过活化培养的组织碎片转移到新的涂布有活化基底的培养皿中，添加原代培

养液，在CO

2

培养箱中进行原代培养，培养8～10d后将组织碎片转移至新的涂布有活化基底

的培养皿中，重复原代培养过程若干次，得到原代细胞；

S6：将所述原代细胞以每瓶10

4

个细胞的浓度进行接种，采用经过照射的3T3细胞作滋养

层，加入传代培养液进行悬浮培养，得到传代细胞。

2.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S1的具体方

法如下：

在无菌条件下采集肺叶样本，浸入L-15培养液中，切开气管，并切成1cm

2

的正方形片状，

得到肺泡上皮组织的组织碎片。

3.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S2的具体方

法如下：

配置用于细胞贴壁生长的活化基底，取1ml涂布在6cm培养皿底面，置于36.5℃的CO

2

培

养箱内放置2h，使所述活化基底固化，并加入5ml活化培养液。

4.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S3的具体方

法如下：

在培养皿底部表面边缘用解剖刀刻画出1cm2的正方形，并去除其中的活化基底，形成

接种位置；将所述组织碎片上皮面向上移入所述接种位置中，去除活化培养液，在室温下静

置3～5min，使组织块贴附在培养皿底壁。

5.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S4的具体方

法如下：

向接种后的组织碎片中添加3ml DMEM培养液，放入可控气室，向气室中注入混合氧气，

将气室置于摇床上，在36.5℃、10r/min条件下培养24h，然后更换HB培养液和混合氧气，继

续培养6～8d，每2d更换一次培养液和混合氧气；

所述混合氧气为50％O

2

、45％N

2

以及5％CO

2

。

6.如权利要求1所述的人肺泡上皮细胞分离与培养方法，其特征在于，步骤S5的具体方

法如下：

S5.1：用新的10cm培养皿凸部活化基底，并对活化基底底部进行真空吸引，用解剖刀刻

画新的接种位置，并将组织碎片转移至新的培养基中，添加无菌DMEM培养液，室温下放置3

～5h；

S5.2：加入10ml LHC-9培养液，在湿化的5％CO

2

培养箱中进行原代培养，每3～4d更换培

养液；

S5.3：培养8～10d后，将组织块移入新的涂布有活化基底的培养皿中，重复步骤S5.2若

2