2024年6月7日发(作者：)

ODS柱

一种常用的反相色谱柱。

固定相，常用十八烷基(ODS)键合相，因此称为ODS柱

也叫C18柱

最常用的"万能柱"填料为"C18"，简称"ODS"柱，即十八烷基硅烷键合

硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极

为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)

是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物

大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛。

近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了CH、

C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶（20～40μm）。

按键合到基质上的官能团可分为：

⑴反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、

C4等。

⑵正相柱：填料是极性的，官能团为－CN氰基、－NH2氨基等。

⑶离子交换键合相： 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。

阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。 ( 由于硅胶基质的键合相只能

在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要求有更宽的pH范围，因

此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。) 流动相：

反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙

醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 最常用的流动相组成是："甲醇-H2O"和"乙

腈-H2O"，由于乙腈的剧毒性，通常优先考虑"甲醇-H2O"流动相。 反相色

谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不

易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来。流动相的pH对样品溶质的

电离状态影响很大，进而影响其疏水性，所以在分离肽类和蛋白质等生物

大分子的过程中，经常要加入修饰性的离子对物质，最常用的离子对试剂

是三氟乙酸（TFA），使用浓度为0.1％，使流动相的pH值为2～3，这样

可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离介，使其疏水性增加，延长洗脱时间，

提高分辨率和分离效果。 完全离子化的溶质，例如强酸或强碱，其在反相

键合相上的保留值很低，近于死时间流出，不能进行分析。根据离子对色

谱的原理将一种与样品离子电荷（A＋）相反的离子（B－），称为对离子，

加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对，即中性缔合

物，从而增强了样品的疏水性，加大了保留值，改善了分离效果。

正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸

乙酯＜异丙醇 其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80％的顺、反

和邻位、对位异构体仍然要用正相色谱来进行分离。流动相的选择原则是：

①样品易溶，且溶解度尽可能大。②化学性质稳定，不损坏柱子。③不妨

碍检测器检测，紫外波长处无吸收。④粘度低，流动性好。⑤易于从其中

回收样品。⑥无毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高纯度，即色谱纯。⑧

废液易处理，不污染环境。

使用和维护注意事项

色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使

用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。

① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或

者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低

也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转

动不能过缓（如前所述）。

② 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶

剂改变为全部是水，反之亦然。

③ 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才

可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有

时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可

使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基

质被溶解。

⑤ 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样

品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填

有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。

⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗

时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相

的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50~75ml。

下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷

（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所

有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面

重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再

以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以

省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙

腈）冲洗时重复注射100~200µl四氢呋喃数次有助于除去强疏水性

杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚

砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质

污染。

阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲

洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定

相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。

⑦ 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶

剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

⑧ 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，

这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使

柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积

增大。

在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出

1~2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂

湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处

理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的

短柱（5~30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失

一定的柱效，这是值得的。

通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，

只能在pH2~9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强

的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。

新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可

补加填料使柱效恢复。

每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲

醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流

动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，

不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机

冲洗15分钟。