2024年4月10日发(作者：)

引物的应用常识

引物的原理

引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所

有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为

DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，

由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由

RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延

伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。在体外PCR反应中

所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后

用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用

下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应

成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。

1. 不同实验要求的引物选择

在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：

（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）

（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）

（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片

段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假

基因等）

2.引物设计的重要因素

有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的

软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析

常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户

提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus，

•

引物长度和专一性

常见的引物长度为18-30个碱基。 短的引物（≤15碱基）

能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能

提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。

同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。

•

平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域

引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）

-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。

聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定

的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。

•

3’-序列

3’端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它

将提高PCR效率，因为引物-模板符合物的开放将达到最

小。但是，超过3个G/C碱基将会具有负面效果，因为会

降低反应的专一性。