2024年4月27日发(作者：)

16S rDNA鉴定细菌的方法

细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：

1.提取细菌基因组DNA,

2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。

3.琼脂糖凝胶电泳分离

4.胶回收目的片段

5.目的片段测序。

比对获取相似片段。

7.构建系统进化树

试剂：

1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA

的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。

2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），

高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。

3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温

高压灭菌，室温保存。

4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl

（pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。

1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。

5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃

溶解。配置时要戴口罩。

6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。

7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴

化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。

8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。

9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡

苯酚与氯仿/异戊醇。

10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：

242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。

11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)

（0.2 ml），4℃保存。

12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。

13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度

为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多

实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等）

14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L

Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。

15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，

无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避

免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。）

1.1细菌基因组DNA提取

基本步骤：

材料准备

破碎细胞或胞膜—内容物释放

核算分离、纯化

沉淀或吸附核酸，并去除杂质

核酸溶解在适量缓冲液或水中

基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光

观测仪

细菌基因组DNA提取方法综述

细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。不同的方法所选择的试剂会有所不同。

1 快速微量提取法

 取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。

 加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于

37C水浴1hr。

 然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。

 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

 加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm

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