2024年5月5日发(作者：)

实验一 重组表达门冬酰胺酶II工程菌的构建

【实验目的】

1. 了解构建重组质粒的原理

2. 掌握质粒提取方法、PCR技术、酶切等基本技术方法

【实验原理】

门冬酰胺酶，别名L-门冬酰胺酶、天冬酰胺酶或天门冬酰胺酶。L-天冬酰

胺是细胞合成蛋白质的必需氨基酸。肿瘤细胞中的天冬酰胺合成酶含量非常低，

故自身不能合成L-天冬酰胺，需依赖外源L-天冬酰胺才能生存。而L-天冬酰胺

酶可通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成，导致肿瘤细

胞的死亡。人体内正常细胞则因能自身合成L-天冬酰胺，所以受L-ASP的影响

较小。故L-ASP可用于急性淋巴细胞白血病的治疗。目前临床上使用的L-ASP

泛指来源于大肠杆菌的 L-ASP II。从1974年天津生化制药厂开始生产

L-ASP，到1995年吴梧桐教授等进行的天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表

达研究，并首次在国内成功构建了高效表达L-ASP的基因工程菌pKA/

CPU210009，工程菌发酵单位比野生株高出100倍。随后又优化了基因工程菌的

培养条件和发酵工艺，确定了重组L-ASP 的纯化路线，并对重组产品进行了鉴

定。L-ASP的制备纯化工艺越来越成熟，这些研究成果为我国工业化生产优质、

低价的注射用E. coli L-ASP开辟了新的道路。

聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片

段的一种方法，利用DNA变性和复性的特点，由高温变性、低温退火（复性）

及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，

具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

双酶切：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，

限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如

BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公

用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。需要

强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，其实1

个小时已经足够。应用大体系，如100微升。

纯化：纯化PCR产物分为割胶和柱式，柱式更好，因为割胶手法不准，很

容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化可以去除引物，酶切掉的几

个碱基也会被纯化掉，所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

【实验材料】

1. 试剂

pET22b菌液

pET28a-AnsB质粒

LB 液体培养基

氨苄青霉素(Amp)

琼脂糖

TAE缓冲液

染料

Loading Buffer

分子量Marker

PCR试剂盒

酶切试剂盒

纯化试剂盒

2．器材

微量移液器

标准净化工作台

电子天平(精确到10mg)

恒温水浴锅

离心机

Eppendorf离心管架

灭菌的移液器枪头

灭菌的Eppendorf管（1.5ml微量离心管）

PCR仪

电泳仪

凝胶成像系统

摇床

【实验方法】

1 PCR

1.1 PCR反应体系如下：

引物序列

ECAnsB-1: catgccatggatggagtttttcaaaaagacggc (Nco I)

ECAnsB-2a: cccaagcttgtactgattgaagatctgctgga (Hind III)

10× PCR Buffer

dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)

TaKaRa EX Taq（5 u/µl）

MgCl2

Forward Primer（20 μmol/L）

Reverse Primer（20 μmol/L）

DNA template (pET28a-AnsB)

Sterile distilled water

5 µl

4 µl

0.5 µl

4 µl

2 µl

2 µl

1 µl

up to 50 µl

DNA的模版为质粒pET28a-AnsB（预先准备），程序名为Z1。

PCR 扩增程序：95 ℃，1.5 min； 95 ℃，30 sec， 52 ℃，30 sec， 72 ℃，1.5 min，

30 cycles；72 ℃ 10 min。

1.2 电泳检测

电泳检测条件：1%琼脂糖凝胶电泳。

配制方法：50ml TAE缓冲液+0.5g 琼脂糖，微波炉加热沸腾至完全澄清，加入5µl

GOLDWAVE染色液体，插入小梳齿。

点样：2.5 µl样品+1µl 6×或者10× Loading Buffer点样。

电泳时间：120V恒压 30 min

分子量Marker：