液相色谱

2023年11月30日发(作者：)

液相色谱-四极杆/飞行时间质谱联用（HPLC-QTOF）

一、开机

1.打开计算机，LAN Switch电源。

2.打开液相各个模块电源，打开质谱前面的电源开关，等待大约两分钟，当听到第二声溶

剂阀切换的声音(表明质谱自检完成)后，仪器可以联机。

3.在计算机桌面上双击MassHunter采集软件图标，进入MassHunter工作站。

4.如果MassHunter工作站在之前曾经打开和关闭过，请确认在再次打开工作站之前，关闭

MassHunter所有的进程；双击桌面上的图标，在弹出的窗口点击Shut Down，等待所有的

Status都变为Terminated后，点击Close。然后再打开MassHunter工作站。注意：在

MassHunter采集软件关闭后，再次打开之前，必须执行上面的操作，否则无法进入采集软

件。

5. 点击Standby按钮，检查前级真空（典型值应≤2.5Torr）和高真空，等到高真空≤2×10-

6Torr后，关闭工作站。

6. 进入仪器诊断软件界面，在菜单上选择Connection > Connect，输入IP地址

192.168.254.12，点击OK。

根据不同的情况，选择不同的Condition HV的模式。 0.6 Hour Cycle (Quick Vent) 适用于

Q-TOF短暂关机后的Condition，比如更换泵油，短时间停电等。 2 Hour Cycle (Optics

Service) 适用于对Q-TOF关机，进行简单维护后的Condition，比如清洗毖绅管等。 8

Hour Cycle (TOF Service) 适用于对Q-TOF关机，进行比较长时间的维修后的Condtion，比

如仪器出现故障后Agilent工程师上门维修后再次开机。 13 Hour Cycle (Installation) 适用于

Q-TOF安装时第一次开机后的Condtion；当者是比如长假关机后再次开机。

7. 标签栏显示Instrument ON/OFF界面，点击Condition HV。

8. 当Condition HV结束后，在File菜单上选择Connection > Disconnect，关闭 TOF

Diagnostics软件。

9. 重新进入MassHunter工作站。

二、调谐和校正

准备调谐和校正

将稀释好的TOF-ESI调谐液装入Calibrant B瓶中，调谐液的配置方法见下表(以制备100mL

调谐液计算)。

G6510A/G6220A/B (Dual ESI) G6530A (AJS)

调谐模式 正模式* 负模式** 正模式 负模式**

稀释倍数 4 4 10 40

调谐原液 G1969-85000 G1969-85000 G1969-85000 G1969-85000

调谐原液用量 25 mL 25 mL 10 mL 2.5 mL

乙腈 71.25 mL 71.25 mL 88.5 mL 88.5 mL

水 3.75 mL 3.75 mL 1.5 mL 1.5 mL

切换到调谐界面左键/当右键点击Q-TOF图标，选择On。然后在Context下拉框中选择

Tune，切换到Tune界面，如果出现Method Editor对话框，选择No。接着出现Agilent MS

Acquisition Worklist Pane对话框，选择No。

对于Q-TOF仪器，TOF部分的调谐和校正有下面几种模式：Initial Tune，Standard Tune，

Quick Tune，Check Tune，Set Detector Gain以及Calibration。 Initial Tune做的项目最多，所

需时间最长；Standard TOF Tune次之；Quick Tune最少。 Check Tune只是检查仪器状

态，不会修改任何参数；Calibration只校正质量轴。 注意：建议每天仪器运行之前运行

Calibration。

三、方法编辑

在桌面上双击数据采集软件图标，进入MassHunter数据采集界面。在这个界面中完成所有

HPLC和Q-TOF的方法参数设置。

新建方法

通过菜单File>New>Method创建一个新的方法。当者通过菜单File>Open>Method来打开

D:MassHunterMethods目录下的默认方法Default.m。在这个方法的基础上创建新的方

法。注意：不建议使用已有方法直接选择“另存为”来创建新方法，最好的办法就是像上

面所述通过全新的方法模板来创建新方法。

自动进样器选项卡

点击自动进样器页面(h-ALS-SL)，设置自动进样器的参数。Standard injection是指进样器吸

取样品后直接进样分析。 Injection with Needle Wash是指进样器吸取样品后，会先自动清

洗进样针的外壁，然后再进样分析。 Use Injection Program是指对自动进样器的动作按照

自己的需要进行编程，来决定自动进样器一步步如何操作。这种模式很少用到，但对一些

特殊的分析，如氨基酸柱前衍生自动分析是最佳的选择。一般建议设置为Injection with

Needle Wash，即带洗针的进样方式，这样可以显著减少样品交叉污染。

对于一般的应用来说，不要设置High Throughput。其作用是通过减少两次进样的间隔时

间，加快样品分析的速度。这个选项可以一定程度减少每次进样运行之间的等待时间，但

若设置不当也可能会增加交叉污染，降低重现性。

Options和Carryover Reduction页面下的参数一般不需要设置，使用默认值即可。

泵选项卡

点击泵的页面，设置泵的参数。在Setup页面设置泵的流量、流动相比例等。Timetable可

以让您建立一个梯度程序。也可以编写流量和压力的时间程序。可以通过Insert、

Append、Cut、Copy和Paste等功能方便的进行编辑。在Option菜单下可以设置冲程、压

缩因子、及最大流量梯度等。

柱温箱选项卡

在柱温箱编辑画面输入柱温箱温度。大部分应用情况下，左右加热的温度设置成相同值。

Time Table和Options内的参数一般不需设置，使用默认值

Q-TOF选项卡

Time Segments

可以设定不同的质谱采集时间片断，在每个时间片断内还可以设定不同的试验参

数 (Experiment #)。在Q-TOF的参数里面，如果某个参数后标有Seg，则说明这是可以按

照Time Segment来设置的参数。如果某个参数后面标有Expt，则说明这是可以按照

Experiment来设置的参数。

General

在这里设置离子源的各种参数。在此主要应考虑进入质谱的流动相的实际组成及流量确定

适合的Gas Temp，Drying Gas，Nebulizer的值。依据化合物特性及分子量大小来确定适合

的Fragmentor，Skimmer，OCT1 RF Vpp，VCap等。

Source

在此设置离子的极性为正还是负，数据保存方式是棒状图还是轮廓图。以及LC流出的流

动相是流入MS还是废液等。

Acquisition-TOF Mode

在Acqisition界面，如果选择MS (Seg)，则仪器按照TOF模式采集一级质谱数据。这里设

置采集的质量范围，采样速度等。

Acquisition-Auto MS/MS Mode

在Spectral Parameters标签页设定一级和二级质谱的Mass Range，采集速度等参数。四极杆

的分辨率(Isolation Width)一般推荐使用Medium (~4 m/z)。

Collision Energy设置碰撞能量。可以使用固定数值，也可以使用线性变换当用表格设定。

在Precursor Selection I标签页设定母离子选择的相关参数：母离子的数量，是否使用动态

排除当静态排除等。

在Precursor Selection II标签页设定母离子的优选价态。

在Preferred/Exclude标签页设定母离子优选当者排除的m/z值、保留时间、碰撞能量等。

Target MS/MS Mode

在Spectral Parameters标签页设定一级和二级质谱的Mass Range，采集速度等参数。

Collision Energy设置碰撞能量。可以使用固定数字，也可以使用线性变换当用表格设定。

在Target List标签页设定目标母离子及其相关参数，如保留时间，四极杆分辨率、碰撞能

量、采集时间等。

Ref Mass

这个界面来设定是否使用内标校准及内标离子，包括内标离子检测窗口和门槛。常用的

正、负参比离子如下表。对于正离子模式，还经常使用149.02332，这是增塑剂的离子，在

流动相中经常存在。设置参比时，选择2个不同的离子即可。 参比溶液使用９５％乙腈

/5%水来配制。参比物质的加入量可以根据实际参比离子的响应做调整。一般我仧希望参

比离子的响应丰度能够在10000以上。对于Dual ESI离子源，参比溶液是通过参比

Nebulizer导入的。

Chromatogram

Chromatogram界面来设置在运行中实时监视的信号。比如可以显示TIC，EIC，BPC等

等。

Properities

在Properties选项卡设定方法路径、前运行及后运行脚本等信息。在Description中可以输入

方法说明信息。

保存方法

通过File菜单选择Save>Method，当者点击方法保存按钮保存当前方法。也可以通过File

菜单选择Save As>Method来给方法另存成其他名字。

四、运行单针样品

打开样品栏，输入样品名字、瓶号、数据文件名以及数据保存路径等。Injection Volume若

为-1，则表示进样量为方法里面自动进样器参数下的进样量。若为一个有实际意义的值，

则实际进样量就是该数值，方法里面自动进样器参数下的进样量被忽略。

调整实时绘图：在实时色谱图显示区单击鼠标右键，单击Change，在弹出的对话框中左侧

选择想要监视的信号单击Add添加，设定范围后，单击OK。

五、编辑和运行Worklist

工作表是自动进行样品分析的一系列指令。使用工作表，可对多个样品实现自动进样分析

创建工作表

通过File菜单选择New>Worklist创建新工作表。 工作列表面板点击右键，通过弹出的菜

单可以实现添加单个当多个样品，复制，插入等功能。这和通过Worklist菜单能实现的功

能相同。

添加一个样品

从Worklist菜单中选择Add Sample 。工作列表表格就添加了一行新的样品。在工作列表表

格输入以下样品信息：样品名称，样品位置，方法，数据文件名称，样品类型，进样体

积，注释和级别名称等。

添加多个样品

从Worklist菜单选择Add Multiple Samples。在Sample Position 选项卡下，填写样品名称，

数据文件名称，调用方法，方法路径以及数据文件储存路径等。点击sample Position选项

卡，选择要添加的样品所放置的位置。

点击并拖动鼠标来确定一个邻近的区域；在键盘上按住Ctrl点击并拖动鼠标，可以选择其

不相邻的位置的样品；使用键盘的Shift+Ctrl 键在相同地方选择多个样品。点击OK 关闭

Add Multiple Samples 对话框。指定的样品出现在Worklist表格，并且可以进行再次编辑。

从Worklist菜单选择Worklist Run Parameters…，设定工作表的运行信息，方法路径以及数

据文件储存路径等。选中Post worklist ，在弹出的窗口选择SCP_InstrumentStandby，这个

Script的功能是使得Worklist 在运行完毕后仪器自动切换到Standby

保存工作表

使用工具栏的保存工作列表快捷按钮，当者通过File菜单选择Save as > Worklist 菜单保存

工作表.

运行工作表

使用工具栏上的快捷按钮，当者通过Run菜单中选择Worklist，开始运行工作表。

五、关机

注意：关机前务必确认气镇阀处于闭状态，否则前级泵的泵油可能因此回流到质谱的真空

腔内，损坏仪器。

点击MS TOF 图标，依下图所示选择Vent开始放空。也可以单击Context下拉框选择

Tune，切换至Tune画面，在Diagnostics选项卡选择Vent。

系统开始放空，此过程需要等待大约30min，当等涡轮泵的转速到5%以下之后，关闭

MassHunter工作站。 如果想在放空过程中监视系统真空状态，则可以按上所述，在Tune

界面的Diagnostics选项卡观察真空。 关闭TOF及LC各模块的电源。关闭电脑。 如果使

用液氮罐，同时关闭自增压阀门。

注意：在日常操作时，必须每周逆时针拧开气振阀，约20-30min，把油气分离器内多余的泵

油放回泵内。并检查确认泵油液位在标识的最高和最低刻度之间。