Glarea lozoyensis发酵生产棘白菌素类化合物纽莫康定的研究进展_

2023年12月5日发(作者：)

Glarea lozoyensis发酵生产棘白菌素类化合物纽莫康定的研究进展

宋萍;章人川;冯昆达;纪晓俊;黄和

【摘 要】棘白菌素化合物纽莫康定B0(pneumocandinB0)是抗真菌药物卡泊芬净(caspofungin)的前体.棘白菌素类化合物可以通过非竞争性抑制真菌细胞壁中的β-1,3-D-葡聚糖合成酶活性而抑制真菌细胞壁的合成.纽莫康定Bo的生产菌是丝状真菌Glarea lozoyensis.本文从化学结构和生物合成的角度出发,总结了纽莫康定B0的研究进展,主要包括综述了纽莫康定化合物的化学多样性、生物合成途径、优良菌株的选育以及在发酵生产中所面临的工程问题等.

【期刊名称】《中国抗生素杂志》

【年(卷),期】2015(040)001

【总页数】7页(P6-12)

【关键词】纽莫康定;卡泊芬净;抗真菌药物;脂肽

【作 者】宋萍;章人川;冯昆达;纪晓俊;黄和

【作者单位】南京工业大学生物与制药工程学院,南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,南京211816;南京工业大学生物与制药工程学院,南京211816

【正文语种】中 文

【中图分类】R978.1 棘白菌素化合物发现于20世纪70年代，是一类具有六元肽环和不同脂肪酸侧链的微生物次级代谢产物，因为其结构中包含了一个稳定的缩胺醛位点和一个与N相连的长链脂肪链，所以能够特异性地作用于真菌细胞壁，非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-D-葡聚糖合成酶的活性，从而能够起到抗菌效果，且不对人体产生影响。这种明显不同于两性霉素或氮唑类这类传统抗生素药物的作用机制，使棘白菌素类具有广谱性强、耐药性小、副作用小、药物间相互作用小的特点，成为了未来低毒、安全、广谱性的新型抗生素的发展方向。经FDA批准的此类新药目前已有卡泊芬净(Caspofungin, CancidasTM)、米卡芬净(micafungin, MycamineTM)和阿尼芬净(andidulafungin, EraxisTM)。纽莫康定B0(pneumocandin B0)的半合成衍生物卡泊芬净是首个被报道的棘白菌素类化合物(图1)，2001年被美国FDA批准用于曲霉菌感染的治疗。目前，卡泊芬净已成为全身用抗真菌药市场的王牌药物，2011年全球销售额达到6.4亿美元，且排在抗真菌药物的第4位，备受人们关注。

纽莫康定类棘白菌素化合物是Merck公司科学家发现并命名的，生产菌株是由从西班牙马德里的洛索亚流域附近的水塘中分离出来的一株丝状真菌[2]。该菌最初被命名为Zalerion arboricola(ATCC20868)，但后来根据形态、次级代谢产物和DNA指纹分析，被重新命名为Glarea lozoyensis，属于无性繁殖的一个新属[3]，G. lozoyensis菌落形态如图2所示。G. lozoyensis主要有A0和B0两种有效产物。除了纽莫康定B0，G. lozoyensis还能通过 羟基化和氨基酸取代生成多种环状六肽的结构类似物，发酵过程中结构类物的有效控制，能提高后期的分离效率，降低生产成本。因此如何提高B0效价同时降低副产物的比例，是研究人员关注的方向。本文针对纽莫康定B0生产现状进行了总结，从该类化合物的化学多样性、菌种选育、生物合成以及发酵特性等角度对纽莫康定B0发酵调控进行了阐述。

G. lozoyensis产的纽莫康定是一类由六肽和脂肪酸构成的酯肽[4-5]。G. lozoyensis 除能产生A0和B0两种主要产物外，还能产生B1、B2、C0、D0和E0等12种类似物，不同氨基酸侧链修饰或氨基酸连接顺序的不同导致了纽莫康定化合物的结构多样性[6-7]。在6个氨基酸残基上(图3)，有4个残基(位置1～4)会发生可选择的羟基化和氨基酸的掺入。目前还不清楚为什么分子会广泛羟基化。一种理论可能是这些官能团的空间位阻阻碍了可能会使分子失活的水解酶。

脂肪酸侧链或氨基酸不同而导致的结构多样性在棘白菌素类化合物中普遍存在。目前已经发现的广义的棘白菌素类化合物(echinocandins)主要有纽莫康定类，棘白菌素类和含硫脂肽类。来源于曲霉菌的棘白菌素类化合物(echinocandin)中，以棘白菌素类B为前体的阿尼芬净是该类棘白菌素的代表药物。棘白菌素类B由Aspergillus rugulosus生产，与其结构类似的阿枯菌素A[8]和牡仑康定[9]相比，这些化合物的差别仅在于脂肪酸侧链的不同；棘白菌素B、C与D，跟棘白菌素B的差别体现在氨基酸侧链的不同修饰上。含硫脂肽类棘白菌素含有磺酰氧基，Coleophoma empetri F-11899是最早被发现的能够生产此类化合物的微生物[13]，以FR901379(WF11899A)为前体的米卡芬净是该类棘白菌素的代表药物之一。产含硫脂肽类棘白菌素的微生物分有两类，一类是腔孢菌(Coelomycetes)，它们能够生产与FR901379结构类似的脂肽抗生素，如FR209602和FR220897，它们与FR901379的差别在于某些氨基酸侧链的不同，但其脂肪酸侧链均为棕榈酸[14-15]；另一类是丝孢菌(Hyphomycetes)，包括Chalara sp.和Tolypocladium parasiticum，它们所产脂肽类抗生素与FR901379有相同的肽环，差别仅在于脂肪酸侧链不同[16]。

纽莫康定B0是由苏氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、3,4-二羟基高酪氨酸、3-羟基谷氨酰胺、反式-3- 羟基脯氨酸、4,5-二羟基鸟氨酸这6个氨基酸组成的肽环，通过肽环上的4,5-二羟基鸟氨酸的氨基酸残基N-末端连接一个10,12-二甲基肉豆蔻酸组成的酯肽。同位素标记显示B0的3,4-二羟基高酪氨酸来源于酪氨酸和乙酸盐；脂肪酸侧链10,12-二甲基肉豆蔻酸的两个甲基来源于甲硫氨酸。其它组分则来源于相应的氨基酸残基[8]。

2012年，Youssar完成并公布了对纽莫康定B0高产菌株G. lozoyensis ATCC

74030的全基因组测序结果[9]。2013年，Chen等对野生菌G. lozoyensis

ATCC 20868进行了基因组测序发现了纽莫康定B0的生物合成基因簇[10]，如图4(a)所示，该基因簇全长约116kb，通过对基因簇结构和功能的分析推测纽莫康定是通过非核糖体肽合成酶-聚酮合成酶(NRPSs-PKSs)杂合途径合成的。

2.1 主链的合成

纽莫康定B0的生物合成起始于聚酮合酶催化的肉豆蔻酸的组装，GLPKS4编码的PKS从乙酰基开始组装肉豆蔻酸。PKS包含一个甲基转移酶结构域，使用甲硫氨酸提供的两个甲基，形成10，12-二甲基肉豆蔻酸的两个甲基侧链。10，12-二甲基肉豆蔻酰以羧酸的形式从GLPKS4上释放，这个羧酸通过酰基辅酶A连接酶(GLAREA10043)转变成CoA硫酯，形成聚酮化合物中间体。聚酮化合物中间体在酰基转移酶(GLAREA10021)作用下定位到非核糖体肽合成酶GLNRPS4的第一硫醇(T)域，酰化纽莫康定的4,5 –二羟基鸟氨酸，启动了环状六肽延伸，继而以核糖体多肽合成机制依次连接3-羟基脯氨酸，3-羟基谷氨酰胺，3，4-二羟基高酪氨酸，4-羟基脯氨酸和苏氨酸形成肽链。

2.2 稀有氨基酸-L-高酪氨酸的合成

棘白菌素类化合物中包含一个非蛋白质氨基酸L-高酪氨酸。棘白菌素B是另外一种已阐明合成机制的棘白菌素类化合物，Emericella rugulosa NRRL 11440 合成棘白菌素B是通过非核糖体肽合成酶途径，L-高酪氨酸的合成由hytA、B、C、D、E和F六个基因负责，如图4(b)所示。纽莫康定肽环的第四位的L-高酪氨酸的合成，与GLNPRS4的下游的5个连续的基因相关。这5个连续的基因，跟hyt相比具有较高的同源性。GLAREA10037编码顺乌头酸酶，(与hytD 62%的同源性)，GLAREA10038编码异苹果酸脱氢酶(与hytC 71%的同源性)，GLAREA10039编码2-异-苹果酸合成酶(与hytA 63.7%的同源性)，GLAREA100340编码转氨酶(与hytB 64%的同源性)，GLAREA10041编码非血红色素双加氧酶(与hytE 63.8%的同源性)。但是在G. lozoyensis中，跟hytD和hytE对应的基因的转录方向不一致，而且跟hytF对应的P450氧化酶基因是缺失的。

2.3 纽莫康定合成基因簇中的其他关键基因

像其他真菌NRPS和PKS基因簇一样，合成纽莫康定的NRPS基因簇(GLNRPS4)和PKS基因簇(GLPKS4)中同样包含一个或多个细胞色素P450，类克拉维胺合酶蛋白(加氧酶)，锌指转录因子，和一个ABC转运体。

脯氨酸3-羟化酶和脯氨酸-4-羟化酶属于2-酮戊二酸依赖性双加氧酶类，能将脯氨酸转换为3-羟脯氨酸和4-羟基脯氨酸[11]。基因簇中共有四个加氧酶(GLAREA10033、GLAREA10041，GLAREA10042和GLAREA10044)，而六肽环中有2个脯氨酸需要转化，因此4个加氧酶中有2个可能参与脯氨酸转化。

基因簇中还存在两个细胞色素P450单加氧酶(GLAREA10030和GLAREA10031)，被列为在CYP 512A家族，可能是负责氨基酸的羟化。这些加氧酶也可能参与亮氨酸到甲基脯氨酸的转化机制中[12]。

GLAREA10050可能是锌指转录调节因子，属于C2H2和C2HC锌指家族，是DNA结合蛋白和转录因子[13]。这个家庭的成员是一些调节的次生代谢产物合成的通路特异性的转录调节因子，例如，RUA1激活Ustilago maydis中黑粉菌酸的合成基因簇[14]。因此，锌指蛋白GLAREA10050的最有可能是glpks4和glnrps4的转录调控因子。

ABC转运蛋白是普遍存在的膜蛋白，可以运输多种有底物特异性的内源性和外源性有毒化合物[14-15]。基因簇中ABC转运蛋白(GLAREA10036)，很有可能是用于分泌胞内纽莫康定，从而避免细胞内积累，降低了细胞毒性。 2.4 纽莫康定结构类似物合成机制的差异

A0和B0的结构差异在于B0中是3-羟基脯氨酸，A0中是3-羟基-4-甲基脯氨酸。虽然两者之间存在一个甲基的差异，但是研究显示两者的合成方式完全不同，B0中3-羟基脯氨酸来源于脯氨酸，而A0的3-羟基-4-甲基脯氨酸来源于亮氨酸的环化作用。因此A0不是B0甲基化后形成的，B0也不是A0脱甲基化形成的。因此若要得到不同的产物则需要不同的发酵条件和培养基组成[8]。

C0和B0的结构差异在于B0中的反式3-羟基脯氨酸，在C0中是反式-4-羟基脯氨酸。上述两个氨基酸分别是脯氨酸经脯氨酸3-羟基化酶(proline 3-hydroxylase，P3H)或脯氨酸4-羟基化酶(proline 4-hydroxylase，P4H)羟基化后生成的。但是单纯的调节的两个羟化酶的活力可能并不能达到预计调控C0和B0的比例。反式-3-羟基脯氨酸和反式-4-羟基脯氨酸的比例，而不是这两种氨基酸的绝对量影响了纽莫康定的生产[11]。在反式-3-羟基脯氨酸浓度不变的条件下，反式-4-羟基脯氨酸的增加与C0的产量成正比，因此C0的生成是因为在合成过程中肽合成酶错误地将反式-4-羟基脯氨酸替代反式-3-羟基脯氨酸掺入合成的结果[16]。敲除P4H可能能消除结构类似物C0。

为了使G. lozoyensis产B0而不产A0，Masurekar等[7]采用NMU(N-亚硝基-N-甲基脲)和NTG(N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍)对A0生产菌G. lozoyensis

ATCC20868进行复合诱变，最终得到了B0高产菌ATCC74030，其产量达到241mg/L，较出发菌株ATCC 20868提高了13倍，作者指出亮氨酸环化作用的缺失可能是在B0高产菌ATCC 74030中B0高产的原因。B0高产菌ATCC

74030菌株的诱变过程如图5所示。国内，Xu等[17]以ATCC 20957为出发菌株，用NTG处理菌体悬浮液再制成原生质体，通过筛选原生质体再生后的单菌落，获得了一株高产菌株CGMCC 2933。该菌的B0产量达到5.2g/L，较出发菌株提高了4.7倍。上述诱变选育显著提高了B0产量，同时降低了结构类似物的比例，为发酵工艺的开发奠定了基础。

虽然通过大体积的硅胶柱可以有效分离纽莫康定的结构类似物，但是在发酵水平提高纽莫康定B0的产量并控制结构类似物的比例，从而降低下游分离的成本，是发展纽莫康定B0发酵工业的核心。表1总结了发酵条件对纽莫康定B0及其结构类似物产量的影响。

4.1 前体

Petersen等[20]考察了苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和精氨酸对纽莫康定发酵的影响。苏氨酸和丝氨酸的添加增加了“丝氨酸族”纽莫康定B0和B5；精氨酸能显著增加C0的产量；脯氨酸的添加增加了B0和E0，减少C0和D0。脯氨酸的添加对B0效价的影响显著：当培养基中添加10g/L的脯氨酸的时候，B0的效价达到494unit/L， 是没有添加脯氨酸的1.8倍。脯氨酸的加入同时增加了反式-3-羟基脯氨酸和反式-4-羟基脯氨酸的合成，而且反式-3-羟基脯氨酸: 反式-4-羟基脯氨酸的比例维持较高的水平。

4.2 碳源

低浓度的葡萄糖对纽莫康定的合成就有抑制作用，而甘露醇和果糖有利于G.

lozoyensis合成纽莫康定。研究者认为甘露醇优于其它糖类碳源的原因在于它是一种储存型碳源，代谢阻遏效应小，能在发酵稳定期为次级代谢产物的生产提供充足的NADPH[18]。在100g/L甘露醇作为碳源的条件下，发酵21d时B0效价达到800mg/L。在甘露醇作为碳源时发现，镁离子限制有利于纽莫康定的积累，因为过多的镁离子会激发甘露醇转化成生物量，造成在生长期结束后没有能量支持抗生素的生产[18]。在125g/L果糖作为碳源的条件下，可以有效的缩B0的发酵时间缩至375h，发酵结束时的效价约400unit/L[16]。虽然高浓度的果糖(低浓度果糖为40g/L)会造成纽莫康定(B0+C0)产量的下降34%，但是会显著降低C0的含量(C0降低了250%，B0降低了30%)。因此采用高浓度的果糖可以有效控制结构类似物的比例。在发酵中期添加150mmol/L NaCl或者116mmol/L Na2SO4至低果糖的发酵中去，使其回到了高果糖条件的效价和同分异构的比例，因此作者认为是渗透压和水活度影响了纽莫康定产量的变化。实际上，在某些真菌中，甘露醇和果糖可以相互转换：甘露醇可以通过苹果酸脱氢酶生成果糖，果糖再通过己糖激酶、1-磷酸甘露醇脱氢酶(MPD)、1-磷酸甘露醇磷酸化酶(MPP)再生成甘露醇。因此研究G. lozoyensis中甘露醇和果糖的代谢机制，对提高纽莫康定B0的产量也有一定的作用。

4.3 温度

纽莫康定B0的发酵过程对温度比较敏感，研究发现23.5～25℃最有利于B0的生产[19]。当温度高于25℃时，底物谷氨酸的消耗速率就会降低。在28℃的时候，菌体的生长就会受到抑制，谷氨酸的消耗速度抑制更加明显。在传统发酵工业中，通常在发酵后期通过降低发酵温度来降低菌体的代谢活力。而作者提出可以通过提高温度至28℃(在28℃条件下菌体不会生长，却具有活力)来实现这个目的，同时提高温度还能降低发酵培养基的粘度。

4.4 pH

纽莫康定B0在pH5.2条件下可以获得最优的体积生产速率(52unit/L)，在pH5.6条件下可以获得最高的比生长速率(1.1unit/g DCW，dry cell weight)。结构类似物的比例、oxygen uptake rate(OUR)、细胞干重、粘度、流体力学均不受pH的影响。pH(pH4.5～6.5)对0.8m3的发酵规模影响不大[19]。但是碱性pH会造成脯氨酸和二羟基鸟氨酸残基间的半酰胺键断裂致使纽莫康定降解，因此在培养基中添加较高浓度的KH2PO4、(NH4)2SO4可以抑制pH的上升[18]。

纽莫康定的生产菌G. lozoyensis为丝状真菌，在生产过程中要面临两个问题：菌丝形态的变化对产物生产的影响和丝状细胞导致的发酵液黏度的升高。一系列的放大研究都是围绕上述两个问题。 许多其它次级代谢产物的生产过程中，菌丝形态变化被认为是一个重要的生产指标。Pollard等[21]研究了0.8～19m3体系下对G. lozoyensis发酵过程中发酵液的流变特性以及影响流变特性的因素进行了详细研究，指出发酵液的假塑性完全是由于生物量的积累而非发酵培养基本身或者胞外代谢产物造成的。发酵过程中菌丝形态大部分是分散的形态，少于5%的是球状(直径450μm±54μm)。

发酵液粘度的升高会影响发酵体系的传质、传氧和传热问题。0.07和0.8m3发酵罐的数据[19]显示氧的溶解状态对于放大过程中控制结构类似物的产生至关重要。在19m3罐子中成功实现了放大并控制了结构类似物B1、B5和E0：通过降低培养基浓度至原来的80%，致使生物量减少，最终使发酵液的黏度降低20%，进而提升了氧气传递速度，使溶氧维持在80%，在此条件下，500h时B0浓度达到55units/L，与0.8m3的条件下接近。

Pollard等[22]又进一步阐述了这种高黏度发酵放大过程的放大标准。基于过程敏感性和流态分析的经验放大策略，在57m3的发酵罐维持了19m3罐的发酵水平。

本文主要综述了G. lozoyensis合成纽莫康定B0的生物合成机制及在发酵水平提高B0的产量并控制结构类似物比例的研究。卡泊芬净作为新型抗生素在临床上表现出了较好的疗效，但是目前已出现了卡泊芬净的耐药性病原菌。如何利用已有资源，定向创造新结构、新活性化合物以及提高微生物次级代谢产物的产量，成为当务之急。因此对次级代谢产物生物合成基因(簇)的克隆与功能鉴定，采用分子生物学基础上的组合生物合成和代谢工程成为解决上述两个问题的重要手段。目前已完成的G. lozoyensis全基因组测序工作和G. lozoyensis外源基因转化体系的建立，为进一步推动纽莫康定及其相关产品的发展奠定了基础。

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