2024年4月10日发(作者：)

实验四 设计PCR引物

一、 实验目的

学习引物设计软件PrimerPremier5的基本使用方法。

二、PCR引物设计原理与参数要求

引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生

错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增产物，在

EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与

理论上成倍增长量的接近程度。

①引物长度：特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在

近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷

酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反

应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。

总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性

提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核

苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。

②引物的二级结构：包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会

影响引物和模板的结合从而影响引物效率。

对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续

的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或

5’端的要求可适当放宽。

引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发

卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。

应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。

③引物GC含量和Tm值：PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50％的G+C的

20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃范围内，这可为有效退火提供足够热度。

一对引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为

降低了Tm值导致特异性的丧失。这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。

若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围

内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和Tm值的协调非常关键。

一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不

要相差太大，20摄氏度范围内较好。

④引物的额外序列与退火温度：若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚

合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长的引物。一般说来，引物5’

端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对

的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5’端序

列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。

在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是，大多数限制酶的有效切割要求在它们

的识别序列的5’端有2至3个非特异的额外碱基，这样就会增加引物的非模板特异序列

的长度。长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算，而这对于确定PCR反应时