2024年5月8日发(作者:)

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安徽农业科学。Journal ofAnhu ̄A .Sci.2008,36(12):5017—5019 责任编辑孙红忠责任校对卢瑶 

Williams E无血清培养基中绵羊皮肤游离毛囊的培养 

汪长寿,曹贵方(内蒙古农业大学动物科学与医学学院,内蒙古呼和浩特ol0ol8) 

摘要[目的]为研究哺乳动物毛囊的生长机理提供依据。[方法]将分离的蒙古绵羊皮肤毛囊接种到 uiarns E无血清培养基上,研究 

蒙古绵羊皮肤毛囊的体外生长规律,并分析在Williams E无血清培养基中添加胰岛素和氢化可的松对绵羊皮肤毛囊生长和形态的影响。 

[结果]在Williams E无血清培养基上,87.5%绵羊皮肤毛囊生长良好,其平均生长期为19 d,平均生长长度为0.15 rr ̄n/d,前6 d的生长速 

度最快。在培养前15 d,毛囊形态结构无明显变化。随着培养时间延长,毛囊逐渐增长,外根鞘和毛根不断延长,真皮鞘变薄。22 d后, 

毛囊出现贴壁,角朊细胞从外根鞘上移出,毛囊生长速度减慢。添加胰岛素和氢化可的松有维持毛囊形态的作用。[结论]该研究为检 

测某些细胞因子和药物提供了模型。 

关键词毛囊;Willian ̄E无血清培养基;培养 

中图分类号¥826 文献标识码A 文章编号0517—6611(2008)12—05017—03 

Culture ofFreeHairFolliclesfromOvine Skin OHWilliamsE Sertma-freeMedilHn 

W №Cllang-shou et al(College ofAnirnal Seienee and Animal M edicine,Inner Mongolia Agrleulmral University,Hohhot,Inner MongoliaO1O018) 

Abstract lObjectiveJ 1he research aimedto providethe basisfor studyingthe growthmechanism ofhairfollicleinmo/nmals,IMethodI 111ehairfolli. 

e]es isolated from the skin ofMongolia Sheep were inoculated on Williams E serum-flee medium to study the growth law in vitro ofhair follieles from the 

skin of Mongolia Sheep.And the effects of addi ̄insulin and hydrocortlsone to Williaras E serum-flee medium on the growth and shape of hair follicles 

fromthe skin of sheep were analyzed.I Resuit1 0nWillian ̄E serum-freeinedium,87.5%hairfollic]esfromthe skin of sheep growwel1.1he average 

growth period WaS 19 d,the average growth length was 0,15 mm/d and the ∞ spe in early 6 d was hi ̄est.In early 15 d of culture period,the 

morphological structure ofhairlollic]es had no obvious chal ̄ge,With the prolonging of culture time,hairfollieles went up gradually,outer root sheath and 

hair root extended gradually and the derr ̄sheath turned thin.After 22 d,the attachment in hair follic]es and the keratinocyte emerged from Outer root 

sheath andthe growth rate ofhairlollicles slowed.Addi ̄insulin and hvdroeortisone hadthe role ofmaintain ̄the shape ofhairlollides.IConclusionI 

This research provided amodelfor detecting some cytokines andmedicines. 

Key words Hair f0uicle;Wil1iams E senan-free nledillnl;Culture 

毛囊是由多层细胞组成的皮肤附属器官,控制着毛发的 

周期性生长,几乎遍布于全身皮肤。毛分为毛干、毛根和毛 

100t,e,/ml,转铁蛋白10te/m]。 

主要仪器设备有c0,培养箱(Fromar Scientiifc,In),显微 

照相系统(Olympus,PM.2o),光学显微镜(Olympus,BH.2),倒 

置显微镜(Olympus,cK sIJ)。 

球三部分。露在皮肤外的为毛干,埋在皮肤内的为毛根,包 

在毛根外面的上皮和结缔组织形成的鞘为毛囊。哺乳动物 

的毛都是由毛囊产生的,毛囊虽然形形色色,但它们的结构 

基本相同。调节其生长、分化的因子目前还不清楚,体内由 

于影响因子太多,难以研究其生长机理。Hardy等曾将未分 

化出毛囊的胚胎鼠皮肤种植到血浆凝块中进行悬滴培养,并 

培养出一种与机体内正常毛囊相似的毛囊结构…。此后 

1.3方法采集2~3岁成年绵羊背部皮肤,24 h内予以培 

养,来不及培养的样置于Williams E无血清培养基(含青霉素 

400 U/ml,链霉素100 te/m])中,4℃冰箱保存。在超净工作 

台中于解剖显微镜下分离毛囊。分离前把皮片用75%酒精 

棉擦净,把毛干尽量全部剪掉,然后用D.Hanks(含青霉素400 

Philpott等建立了人头皮游离毛囊培养的模型,采用悬浮培养 

U/m1,链霉素100t,e,/m1)反复冲洗3~5遍,每遍3~5 min,然 

后移入含有Williams E无血清培养基的培养皿中,剪成0.1~ 

0.3 cm宽的皮条,再从真皮皮下组织交界处剪开,在解剖显 

微镜下用显微外科镊轻轻夹住毛囊远端,顺毛囊方向轻轻从 

皮下组织中拔出或切取完整无损的生长期毛囊进行培养,游 

离的完整毛囊移入24孑L板(Costar产品)中,每孑L 1个毛囊,加 

入0.5 rnl Williams E无血清培养基,37 oC、5%co2、95%空气 

中悬浮培养3~5 d,不换液,每24 h在倒置显微镜下用目镜 

测微尺测毛囊生长长度并照相。另外,新鲜分离的或培养后 

的完整毛囊陆续做组织切片:经多聚甲醛液固定2~3 h后, 

法在体外培养出完整的游离单个毛囊器官,并研究了一些有 

关细胞因子、皮质类固醇及药物对毛囊生长的影响_2 J,为某 

些药物的临床药理研究带来了方便。该实验进行了游离毛 

囊的培养,体外建立一个理想的毛囊生长模型,可供研究毛 

囊体外生长规律,并可分析实验条件下相关因子对其生长及 

代谢的影响。 

1材料与方法 

1.1材料北方寒旱区牧养蒙古绵羊皮肤毛囊,由内蒙古 

自治区巴彦淖尔市乌拉特前旗后山牧场提供。取活体绵羊 

背部皮肤1~2 cm2,经无菌处理后剪成0.1~0.3 em宽的皮 

条,再从真皮皮下组织交界处剪开,轻轻切取毛囊,培养于加 

有胰岛素、氢化可的松的Williams E无血清培养基中培养。 

1.2试剂和设备Williams E无血清培养基:Williams E无血 

清培养基中,加入L广谷氨酰胺2 mmol/L、Hepes 2 mmol/L、胰 

2%琼脂预包埋,再用多聚甲醛固定,常规脱水、浸蜡、包埋和 

切片,HE染色,SAC染色观察(X 4o)。 

2结果与分析 

共进行了14批毛囊培养,每批3板,每板 根毛囊, 

87.5%毛囊均有较快的生长,12.5%毛囊基本不长,或长得 

很短。一般前6 d长得最快,前6 d平均生长长度为0.36 

arm/d;平均生长到第19天,平均生长长度为0.15 mm/d。平 

岛素10 ̄,/ml、亚硒酸钠10 ng/ml、青霉素100 U/ml、链霉素 

基金项目 国家自然科学基金项目(3 8);内蒙古自治区自然科 

学基金项目(200208020402)。 

作者简介汪长寿(1975一),女,内蒙古通辽人,在读博士,讲师,从事 

收稿日期

动物组织与胚胎发育学研究。 

2008-03 17 

均每天增长率及增长长度见表1,变化趋势见图1、2。新鲜分 

离的毛囊及培养的毛囊分别照相,在显微镜下能观察出毛囊 

逐渐增长,外根鞘和毛根不断地延长,真皮鞘没有明显的变 

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5018 安徽农业科学 2008盎 

化;前15 d毛囊总的形态结构没有明显的变化,随着培养时 

间延长,毛囊下部真皮鞘和外根鞘变薄、毛囊明显变细;毛根 

下端发白、发亮;毛母质细胞逐渐上移,毛球部变小,毛乳头 

皇0 

n 6 

眭5 

一蓦n 4 

紧凑成一团。第22天后出现部分毛囊贴壁,角朊细胞从外 

根鞘上移出,长成一片,均是从毛囊上端或中段先长出角朊 

细胞;一般22 d后大多数毛囊会贴壁生长,贴壁后毛囊稍有 

延长,然后稍有缩短。 

表1 Williams E无血清培养基中培养的毛囊(前19 d) 

1hbIe 1 The hairfollilce cultured out sermn-lessWilliamsEmedlmn(Firat 

登 0.。 

毒害0.2 

心 

n 1 

O 

1 3 5 7 9 l1 13 15 17 19 

培养:K.4 ̄:ChItured days 7f d 

图1绵羊毛囊每天的增长率 

量 .1 The alrve for grow ̄rate 0f OVl/le hair follilecs cultured抽 

咖 

19 d) 

days 

箍, 

rm。lerl d8ys h哪。 l

州 

鲁 

鲁 

1 

2 

3 

O.375 

O.542 

O.∞0 

0.391 

O.841 

1.333 

1】 

12 

l3 

O.025 

O.Oo8 

O.晒O 

3.558 

3.641 

3.658 

4 

5 

O.367 

O.225 

1 749 

2.149 

14 

15 

O.075 

O 

3.708 

3.724 

6 

7 

0.433 

0.225 

2.516 

2.899 

16 

17 

O 

0 

3.733 

3.741 

萋量 

薹 

累计培养天数Acctmalative cultrmd daysⅣd 

8 

9 

1O 

0.125 

O O83 

O.O83 

3.233 

3.341 

3.499 

l8 

l9 

0 

0 

3.799 

3.808 

图2绵羊毛囊累计增长率 

2 The o’’曲cul-ve 0fo ̄llehairfollilesc cultured/n v/tro 

图3新鲜分离毛囊 

Fig.3 Fresh hairfollicles isolated 

图4快递生长期毛囊 

№.4'hie hairfoUidesin瑚p沁 

growing period 

图5培养后期毛囊 

ng.5'hie hairfoUldes atlater 

cadmre stage 

from ovine sidn 

图6培养1 d的毛囊 

ng.6 The hairfollile culcturedfor1 day 

图7培养2 d的毛囊 

Fig.7 The hairfollile cultcuredfor2 days 

图8培养5 d的毛囊 

Fig.8 Thehair follile culcturedfor 5 days 

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36卷l2期 汪长寿等Wllliar ̄E无血清培养基中绵羊皮肤游离毛囊的培养 5019 

3讨论 

加表皮细胞生长因子、转化生长因子歌佛波醇等,而是加了 

氢化可的松和胰岛素。由于Kondo报道在含有2o%血清的 

实验分离毛囊(图3)时去除了真皮以上部分,不含皮脂 

腺等附属结构,在毛囊生长延长过程中,内、外根鞘和毛干共 

同延长。Williams的实验证实,将毛囊在不同部位截断,其根 

鞘和毛干的生长点不同:当在皮脂腺以下横断毛囊,再进行 

培养,横断操作刺激了外根鞘的生长,且未抑制毛母质细胞, 

毛干继续延长,所以表现出根鞘和毛干的共同生长(图4~ 

8);生长后期毛囊基本保持原来的性状,但比新鲜分离的毛 

培养基中培养,虽然能保持适当的增长速度,但其生长速度 

较低 J,说明高浓度的血清对毛囊的生长具有抑制作用。因 

此,该实验中没有在Williams E无血清培养基加入血清,而是 

加入了胰岛素等相关药品。由此看来,该实验不仅加入的因 

子少,节约培养成本,而且达到了预期的培养效果。文献报 

道 J,胰岛素、氢化可的松具有明显的促进毛囊生长或维持 

毛囊形态的作用,亚硒酸钠和转铁蛋白对毛囊的生长或形态 

维持也有一定作用。此外,Irnai等研究表明,毛囊在31 条 

件下生长较37℃时好l6J。Hamlon等的研究结果表明,毛囊 

与毛干长度在培养的最初5 d的增长基本相等,以后毛干生 

囊细长,而且30%的毛囊中上端部位长出角朊细胞(图4) j。 

笔者的实验结果与Williams描述的相符。实验还观察到,如 

分离毛囊不彻底、毛囊周围残留皮肤真皮组织,其生长速度 

比其他毛囊缓慢,容易污染。在体内毛发的生长速度是不一 

致的,除受到一些细胞因子、激素、营养等因素的影响外,还 

与季节、年龄等有关,一般毛发生长长度平均0.27~0.40 

mm/d。该实验中培养毛囊在前6 d平均生长长度为0.36 

mm/d,最终平均生长长度为0.15 mm/d,平均生长天数为19 

d,最长生长天数为25 d。毛囊存活到35 d以上,最长达60 d。 

与唐建兵等的“Williams E培养人头皮游离毛囊生长速度高、 

接近体内生长速度”的结果相一致|4j。唐建兵等认为,这样 

的结果可能与Williams E培养液成分中有氨基酸、维生素、微 

量元素等有助于毛囊生长相关l4J。笔者的结果接近于体内 

毛发的生长速度,实验比较成功。这样的游离毛囊培养为检 

长大于毛囊生长,毛囊基部与毛根基部距离缩短 J。Ham'lon 

等用Williams E无血清培养基培养人毛囊,前3 d的生长可达 

0.3眦n/dl6一 。总生长长度为1~3 mm,多数毛囊生长1O~ 

15 d,个别毛囊生长长达17 dE2,8-9J。该实验结果与国外报道 

相似。生长天数略长,多数毛囊能够生长25 d左右,个别毛 

囊在第30天时毛乳头形态仍很规整。 

参考文献 

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测某些细胞因子和药物的作用提供了一个方便的重复性好 

的模型。实验发现有完整真皮鞘的毛囊培养时才有显著的 

生长,因此分离毛囊时保证真皮鞘的完整无损,是成功培养 

游离毛囊的关键。Philpott等对人头皮毛囊进行体外培养结 

果表明,在加有胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、硒化钠、微量 

元素和1%胎牛血清的Williams E培养基中培养,前3 d的生 

长长度为(0.81±0.04)mm/d,而当维持在再加有表皮细胞生 

长因子的培养基中,其生长速度为(0.70±0.05)mm/d引。生 

长因子促进毛发形成,表明它促使毛囊由生长期提前进入退 

化期,而转化生长因子哉佛波醇是抑制毛囊生长,而氢化可 

的松和胰岛素有利于毛囊形态结构的维持。该实验中没有 

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3.3.6加强犬日常生活管理。不要喂生的或未煮熟的肉类 

或脏器食品给犬;健康犬应与患犬隔离饲养;减少犬与猫接 

触的机会;加强宠物犬训练,杜绝随意舔食的坏习惯;在满足 

犬蛋白质和能量的基础上合理搭配矿物质和维生素,以提高 

其免疫力ll 。 

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3.3.7人的预防措施。人不要与犬过于亲密,人犬分室,清 

理犬粪便时要戴手套;与犬接触后一定要洗手。另外建议养 

犬者要定期驱虫,一年驱虫2次。 

参考文献 

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