2024年4月10日发(作者：)

引物的原理

引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能

从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引

物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合

酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA

取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后

用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对

于大多数PCR反 应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。

1. 不同实验要求的引物选择

在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：

（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）

（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）

（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候

还需要考虑可能存在的问题（如假基因等）

2.引物设计的重要因素

有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，

Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前

生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus，

引物长度和专一性

常见的引物长度为18-30个碱基。 短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是

它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量

低下。同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。

平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域

引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为

它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不

稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。

3’-序列

3’端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它将提高PCR效率，因

为引物-模板符合物的开放将达到最小。但是，超过3个G/C碱基将会具有负面效果，因

为会降低反应的专一性。

避免互补的引物序列

引物设计应避免引物自身序列的互补性超过3个碱基。因为这容易使引物形成自身发

夹结构。

上下游引物之间的互补配对也应避免，尤其在作为扩增起始点和关键区域的3’端。因为

这将导致强引物二聚体形成，后者将与所需要的PCR反应竞争资源，导致PCR效率降低，

在极端情况下，甚至导致完全无特异性目的产物生成。

退火温度是基于引物的解链温度（Tm）------计算方法。

最常用的解链温度计算公式如下三种：“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于14个

碱基以下引物有效，

另外，还有GC法则，适用于长于13个碱基的序列，这两种方法都相对不准确。

“盐调整”法相对准确一些，考虑到了反应缓冲液中的中的Na+离子浓度(50 mM

Na+ ,pH 7.0)。

但是不管根据哪种方法计算出的解链温度，都可用于估算最佳退火温度，也都仅作为实验参

考温度。

DNA的化学合成研究起始于上世纪50年代。

1953年英国科学家James Watson和美国科学家Francis Crick依据伦

敦国王学院的罗莎琳富兰克林所拍摄的X光绕射图及相关资料，共同提出

了最早的DNA的双螺旋结构，自此以后，科学家们便开始尝试核酸的人

工合成。

1957～1965年H.G.科拉纳等人设计并合成了由一种、两种或3种脱氧

核苷酸组成的重复顺序的脱氧寡核苷酸片段，并以此为模板进一步复制和

转录，得到了相对应的互补顺序的人工长链 (mRNA)，再用这种人工

mRNA在无细胞体系中进行蛋白质合成。通过分析这样得到的多肽产物的

氨基酸顺序和与模板中核苷酸顺序的对应关系破译了遗传密码。

1958年，英国剑桥大学Todd实验室于首先合成了具有3’→5’磷酸

二酯键结构的TpT和pTpT。

自从Kary Mullis博士于1983年发明的PCR技术之后，加之1976年耐

高温的Taq DNA聚合酶的发现并被分离纯化，PCR技术已成为分子生物

学中被研究最多，应用最广泛的技术之一，其中引物的设计和合成是实现

PCR关键的一环。

1972年H.G Khorana 等人应用磷酸二酯法合成了相当于酵母内丙氨

酸tRNA结构基因的DNA双链。

1979年完成了包括启动和调节顺序在内的共有207个碱基对的大肠杆

菌酪氨酸校正tRNA 基因。

1981年，中国生化学家王德宝完成了酵母丙氨酸 tRNA的全合成，这

是世界上第一个人工合成的具有全部生物活性的RNA分子。

1982年，美国PE公司应用生物系统部(原美国应用生物系统公司，ABl)

推出了世界上第一台全自动DNA合成仪。

2000年9月，ABI最新推出的3900 台式高通量DNA合成仪。现在国

内比较常见的高通量DNA合成仪是ABI3900，MM192和OLIGO192，前

者一次可合成48条，后二者一次可以合成192条。其中以ABI公司的仪器

占我国及世界市场的80～90%。生工生物现在用的是ABI3900高通量合成

仪。