2024年4月27日发(作者：)
光肩星天牛核糖体蛋白基因AgRpS8功能及
表达特征分析
作者：马晓乾 高宇 孙妍 尚尔雨
来源：《林业科技》2022年第04期
摘要： 为解析AglaRpS8功能特征及在光肩星天牛生长发育过程中的作用机制，通过克隆
核糖体蛋白基因AgRpS8的ORF全长序列，采用生物学信息方法分析AglaRpS8基因的理化性
质、结构及功能特征;利用荧光定量PCR检测该基因在不同发育阶段的表达特征。结果表明：
AglaRpS8基因ORF区长度627 pb，编码个208氨基酸，无跨膜区螺旋结构，具6个Motif结
构域，该基因等电点5.21，分子量大小为49.99 KDa，与AmRpS8基因同源性最高，与
TcRpS8-like和TcRpS8基因亲缘性最近。AglaRpS8基因在光肩星天牛不同发育阶段存在显著
的差异性表达，在幼虫1～2龄期，3～4龄期，5龄期相对表达量较平稳，在光肩星天牛成虫
期相对表达量较低，而在光肩星天牛雌虫交配后怀卵的阶段相对表达量达到最高值。
关键词： 光肩星天牛; 核糖体小亚基蛋白S8; 序列结构; 荧光定量; 功能特征
中图分类号： S 763. 38 文献标识码： A 文章编号：1001 - 9499（2022）04 - 0001 - 05
细胞内核糖体在mRNA和tRNA的协同作用下，形成核糖体大小亚基蛋白，真核生物核
糖体的两个亚基分别为60S和40S，几十种核糖体蛋白和几种rRNA构成一个核糖体[ 1 ，
2 ]。研究表明，昆虫体内的核糖体蛋白功能除参与蛋白质的合成外，还参与细胞增殖与分化、
生长发育及调控等生理过程。如核糖体蛋白基因GdRpS3在沙葱萤叶甲不同发育阶段的表达与
其生长发育阶段及环境温度有关，在其成虫滞育过程中起着重要作用[ 3 ]。有研究发现，小鼠
在缺乏营养的条件下，生物体表现出抑制rRNA的合成，进而打破核糖体蛋白与核糖体RNA
之间的平衡关系，而此时多余的核糖体蛋白L5和L11与泛素蛋白连接酶E3（E3 Ubiquitin
Ligases）样蛋白MDM2结合，加速了脂肪细胞的脂解过程，使线粒体内脂肪酸β氧化增强，
对抗生物体缺乏营养的不利环境[ 4 ， 5 ]。而在这一过程中，RpS3、RpS15、RpL5和RpL11
等不同类型的核糖体蛋白发挥调节细胞增殖和营养循环的作用[ 6 ]。
糖体核糖体蛋白RpS8是一类周期素依赖性激酶11（Cyclin-dependent kinases， CDK11）
p46相互作用蛋白，CDK11蛋白家族以丝氨酸（Serine，Ser）或苏氨酸（Threonine，Thr）蛋
白激酶的形式在生物体内参与细胞周期和细胞分化的调控[ 7 ]。有研究发现核糖体蛋白基因
NlRpS8在褐飞虱生长和繁殖中发挥着重要的作用[ 3 ]。光肩星天牛（Anoplophora
glabripennis）是一种世界性害虫，以幼虫在树木主干和主枝中蛀坑取食形成危害，分布广泛，
危害杨、柳、榆、槭等十几种树种，造成严重的经济损失[ 8 - 11 ]。解析核糖体蛋白在光肩星
天牛生长发育过程中的功能作用，有助于探索控制光肩星天牛新的方法或途径，而有关核糖体
蛋白RpS8在光肩星天牛功能特征还不明确。本研究在分析光肩星天牛AgRpS8序列结构及克
隆该基因的基础上，采用生物信息学方法预测其功能，采用实时荧光定量PCR方法解析了该
基因的时空表达情况，为进一步明确AglaRpS8功能特征及在光肩星天牛生长发育过程中的作
用机制奠定基础，以期为光肩星天牛利用靶标基因防治提供新的思路和途径。
1 材料与方法
1. 1 供试昆虫
光肩星天牛采集于哈尔滨市哈平路行道绿化树的糖槭。幼虫和蛹于4～6月、9～11月通
过解剖被害木段收集;成虫于7月上旬至8月下旬通过人工捕捉收集，在实验室内将雌雄成虫
分开，经液氮处理后，放入-80 ℃冰箱中保存备用。
1. 2 主要试剂
Taq PCR Master试剂盒、RNA Extraction Kit 提取试剂盒、Taq MasterMix DNA 聚合酶、
PrimeScript RT reagent Kit、RNA酶抑制剂均购于Takara。Prime
Script RT reagent Kit、CDSⅢ/3′PCR primer试剂盒，GenEluteTM回收凝胶试剂盒、
Plasmid Extraction Mini Kit质粒提取试剂盒等为Sigma公司产品。克隆载体pMD18T、DH5a感
受态细胞由Tiangen生化提供。
1. 3 序列分析
光肩星天牛核糖体蛋白基因AgRpS8（Accession：XP_023310889） CDS序列从Genbank
中查询获得。基因克隆及荧光定量实验所用引物利用Primer Premire 5.0软件进行引物设计（表
1），由上海美吉生物公司完成。AgRpS8基因的同源性采用NCBI中的BlastX和MAFFT進行
序列比对分析;AgRpS8蛋白的分子质量、等电点等理化性质利用在线软件ExPASy进行分
析;AgRpS8蛋白是否具有信号肽用SignalP V4.1程序（http：///
services/SignalP/）进行预测，是否具有跨膜区结构通过TMHMM2.0预测。与其他昆虫的
核糖体蛋白系统发育树采用MEAG7软件进行构建并分析。
1. 4 总RNA的提取及cDNA第一链的合成
各取雌雄光肩星天牛成虫1头，于研钵中浸入液氮研磨，利用RNA Extraction Kit 试剂盒
提取总RNA，并利用PrimeScript RT reagent Kit和CDSⅢ/3′PCR primer反转录，37℃下培养1
h，生成cDNA第一链。合成后置于-20 ℃冰箱内保存，以待后续实验所用。
1. 5 qRT-PCR测定AgRpS8的时空表达分析
收集雌雄光肩星天牛1～2龄、3～4龄幼虫、5龄幼虫、雄成虫、初羽未交尾雌成虫、交
尾后怀卵雌成虫，提取各虫态或龄期RNA。根据CDS序列设计引物和内参基因见表1。使用
50 μL PCR体系反应，在90 ℃下持续35 s， 随后以95 ℃持续10 s，以65 ℃持续30 s，60～
90 ℃以0.5 ℃递增5 s的40个循环生成熔解曲线。每个反应进行3次重复，基因表达量利用2-
ΔΔCt方法计算[ 12 ]。使用统计学软件SPSS19.0分析基因在各样品中相对表达水平，利用单因
素方差（AVOVA）进行多重比较分析基因相对表达量的差异显著性水平（P<0.05）。
2 结果与分析
2. 1 AgRpS8基因序列分析
AgRpS8基因开放阅读框ORF区长度627 pb，编码208个氨基酸，无跨膜螺旋区，N端没
有信号肽，该蛋白属于无跨膜螺旋及信号肽结构蛋白（图1）。经在线软件 ExPASy预测，
AgRpS8基因等电点（Pl）为5.21，分子量（Mw）为49.992KDa。经Hphob 方法分析，
AgRpS8基因序列中，疏水性第121位氨基酸为Hydropathy Score 最高值3.87，第21位氨基酸
为Hydropathy Score 最小值-4.07（图2）。
AgRpS8基因保守结构域预测为PTZ00148超级家族40S核糖体蛋白S8（40S ribosomal
protein S8），其中长度1-618pb与其一致，E-value值1.18e-115（图3）。从AgRpS8中发现
了6个p-value 值较高的Motif结构，为核糖体蛋白家族中常见的保守的结构特点（图4）。通
过BlastP同源性及序列比对结果表明，与AgRpS8同源性排列前三的核糖体蛋白基因依次为：
意大利蜜蜂（Apis mellifera） AmRpS8基因，同源性为87.02%;草地贪夜蛾（Spodoptera
frugiperda）SfRpS8基因，同源性为83.65%;果蝇（Drosophila melanogaster）DmRpS8基因，同
源性为78.37%（图4）。
进一步与其他昆虫核糖体蛋白RpS8建立系统发育树（图6），分析表明，光肩星天牛
AgRpS8与赤拟谷盗的2个核糖体蛋白（TcRpS8-like、TcRpS8）聚集在同一个分支上，表明光
肩星天牛AgRpS8核糖体蛋白与赤拟谷盗的2个核糖体蛋白可能具有类似的功能，亲缘性接
近。
2. 2 AgRpS8基因的时空表达特征
通过pMD18-T载体设计AgRpS8基因的引物，选取引物酶切点XbaI和XmaI（图7），结
果显示，核糖体蛋白基因AgRpS8的相对表达量在光肩星天牛不同发育阶段均有一定量的表
达，在幼虫1～ 2龄期，3～4龄期，5龄期相对表达量较平稳;而在光肩星天牛成虫期相对表达
量较低;但在光肩星天牛雌虫交配后怀卵的发育阶段相对表达量达到最高值2.46，显著高于其
他发育阶段（P<0.05）（图8）。
图6 AgRpS8与其它昆虫RpS8的系统发育树
注：分支上数字代表分支长度，分支颜色表示基于1 000次重复的bootstrap值。绘制系统
发育树的其它昆虫：果蝇（Dm），赤拟谷盗（（Tc），草地贪夜蛾（Sf），意大利蜜蜂
（Am）
图7 pMD18-T载体酶切点
图8 AgRpS8基因在光肩星天牛
不同发育阶段相对表达量
注：1～2 a，幼虫1～2龄期;3～4 a，幼虫3～4齡期;5 a，5龄期;M，光肩星天牛雄性成
虫;VF，处女的雌性光肩星天牛成虫;GF，怀孕的雌性光肩星天牛成虫。小写字母代表AgRpS8
基因相对表达量在不同发育阶段的显著水平（P<0.05）
3 结论与讨论
昆虫体内的核糖体对于维持其正常的生命活动和调控昆虫的生长发育起着关键作用[ 13 -
15 ]。CDK11家族蛋白在细胞增殖和分化过程中发挥有重要的作用，RpS8作为一类核糖体亚
基蛋白，参与调控分泌及代谢途径[ 3 - 5 ]。本研究解析了光肩星天牛核糖体蛋白AglaRpS8基
因序列结构，理化性质和功能特征，在基础上通过基因保守结构域及系统发育分析，
AglaRpS8基因与鞘翅目赤拟谷盗核糖体蛋白TcRpS8和TcRpS8-like在结构与功能上可能存在
相似的作用。
核糖体蛋白AgRpS8在光肩星天牛不同发育阶段均有不同程度的表达，在幼虫1～5龄期
表达量较高，在雄性光肩星天牛成虫和雌性未交配的光肩星天牛成虫中表达量降低，而在交配
后怀卵的雌性光肩星天牛成虫中表达量达到最高值。这一结果表明，核糖体蛋白AgRpS8基因
可能参与光肩星天牛雌虫孕育过程中细胞的增殖和蛋白质合成。本研究初步解析了核糖体蛋白
基因AgRpS8在光肩星天牛不同发育阶段的表达规律，对可能发挥的功能进行了预测，但未进
行验证，是否发挥有其他生理功能作用也尚不明确，因此，有待进一步开展AgRpS8基因的生
理机制及相关代谢通路的研究。
参考文献
[1] 廖昌敏， 张咏祀， 刘小红， 等. 水杉40S核糖体蛋白S8基因的克隆及生物信息学分
析[J]. 分子植物雨中，2020，18（21）：7 008 - 7 014.
[2] Tian Z.C.， Liu G.Y.， Yin H.， et al. RPS8—a new informative DNA marker for
phylogeny of Babesia and Theileria parasites in China[J]. PLoSONE， 2013， 8（11）： e79860.
1. 5 qRT-PCR测定AgRpS8的时空表达分析
收集雌雄光肩星天牛1～2龄、3～4龄幼虫、5龄幼虫、雄成虫、初羽未交尾雌成虫、交
尾后怀卵雌成虫，提取各虫态或龄期RNA。根据CDS序列设计引物和内参基因见表1。使用
50 μL PCR体系反应，在90 ℃下持续35 s， 随后以95 ℃持续10 s，以65 ℃持续30 s，60～
90 ℃以0.5 ℃递增5 s的40个循环生成熔解曲线。每个反应进行3次重复，基因表达量利用2-
ΔΔCt方法计算[ 12 ]。使用统计学软件SPSS19.0分析基因在各样品中相对表达水平，利用单因
素方差（AVOVA）进行多重比较分析基因相对表达量的差异显著性水平（P<0.05）。
2 结果与分析
2. 1 AgRpS8基因序列分析
AgRpS8基因开放阅读框ORF区长度627 pb，编码208个氨基酸，无跨膜螺旋区，N端没
有信号肽，该蛋白属于无跨膜螺旋及信号肽结构蛋白（图1）。经在线软件 ExPASy预测，
AgRpS8基因等电点（Pl）为5.21，分子量（Mw）为49.992KDa。经Hphob 方法分析，
AgRpS8基因序列中，疏水性第121位氨基酸为Hydropathy Score 最高值3.87，第21位氨基酸
为Hydropathy Score 最小值-4.07（图2）。
AgRpS8基因保守结构域预测为PTZ00148超级家族40S核糖体蛋白S8（40S ribosomal
protein S8），其中长度1-618pb与其一致，E-value值1.18e-115（图3）。从AgRpS8中发现
了6个p-value 值较高的Motif结构，为核糖体蛋白家族中常见的保守的结构特点（图4）。通
过BlastP同源性及序列比对结果表明，与AgRpS8同源性排列前三的核糖体蛋白基因依次为：
意大利蜜蜂（Apis mellifera） AmRpS8基因，同源性为87.02%;草地贪夜蛾（Spodoptera
frugiperda）SfRpS8基因，同源性为83.65%;果蝇（Drosophila melanogaster）DmRpS8基因，同
源性为78.37%（圖4）。
进一步与其他昆虫核糖体蛋白RpS8建立系统发育树（图6），分析表明，光肩星天牛
AgRpS8与赤拟谷盗的2个核糖体蛋白（TcRpS8-like、TcRpS8）聚集在同一个分支上，表明光
肩星天牛AgRpS8核糖体蛋白与赤拟谷盗的2个核糖体蛋白可能具有类似的功能，亲缘性接
近。
2. 2 AgRpS8基因的时空表达特征
通过pMD18-T载体设计AgRpS8基因的引物，选取引物酶切点XbaI和XmaI（图7），结
果显示，核糖体蛋白基因AgRpS8的相对表达量在光肩星天牛不同发育阶段均有一定量的表
达，在幼虫1～ 2龄期，3～4龄期，5龄期相对表达量较平稳;而在光肩星天牛成虫期相对表达
量较低;但在光肩星天牛雌虫交配后怀卵的发育阶段相对表达量达到最高值2.46，显著高于其
他发育阶段（P<0.05）（图8）。
图6 AgRpS8与其它昆虫RpS8的系统发育树
注：分支上数字代表分支长度，分支颜色表示基于1 000次重复的bootstrap值。绘制系统
发育树的其它昆虫：果蝇（Dm），赤拟谷盗（（Tc），草地贪夜蛾（Sf），意大利蜜蜂
（Am）
图7 pMD18-T载体酶切点
图8 AgRpS8基因在光肩星天牛
不同发育阶段相对表达量
注：1～2 a，幼虫1～2龄期;3～4 a，幼虫3～4龄期;5 a，5龄期;M，光肩星天牛雄性成
虫;VF，处女的雌性光肩星天牛成虫;GF，怀孕的雌性光肩星天牛成虫。小写字母代表AgRpS8
基因相对表达量在不同发育阶段的显著水平（P<0.05）
3 结论与讨论
昆虫体内的核糖体对于维持其正常的生命活动和调控昆虫的生长发育起着关键作用[ 13 -
15 ]。CDK11家族蛋白在细胞增殖和分化过程中发挥有重要的作用，RpS8作为一类核糖体亚
基蛋白，参与调控分泌及代谢途径[ 3 - 5 ]。本研究解析了光肩星天牛核糖体蛋白AglaRpS8基
因序列结构，理化性质和功能特征，在基础上通过基因保守结构域及系统发育分析，
AglaRpS8基因与鞘翅目赤拟谷盗核糖体蛋白TcRpS8和TcRpS8-like在结构与功能上可能存在
相似的作用。
核糖体蛋白AgRpS8在光肩星天牛不同发育阶段均有不同程度的表达，在幼虫1～5龄期
表达量较高，在雄性光肩星天牛成虫和雌性未交配的光肩星天牛成虫中表达量降低，而在交配
后怀卵的雌性光肩星天牛成虫中表达量达到最高值。这一结果表明，核糖体蛋白AgRpS8基因
可能参与光肩星天牛雌虫孕育过程中细胞的增殖和蛋白质合成。本研究初步解析了核糖体蛋白
基因AgRpS8在光肩星天牛不同发育阶段的表达规律，对可能发挥的功能进行了预测，但未进
行验证，是否发挥有其他生理功能作用也尚不明确，因此，有待进一步开展AgRpS8基因的生
理机制及相关代谢通路的研究。
参考文献
[1] 廖昌敏， 张咏祀， 刘小红， 等. 水杉40S核糖体蛋白S8基因的克隆及生物信息学分
析[J]. 分子植物雨中，2020，18（21）：7 008 - 7 014.
[2] Tian Z.C.， Liu G.Y.， Yin H.， et al. RPS8—a new informative DNA marker for
phylogeny of Babesia and Theileria parasites in China[J]. PLoSONE， 2013， 8（11）： e79860.
1. 5 qRT-PCR测定AgRpS8的时空表达分析
收集雌雄光肩星天牛1～2龄、3～4龄幼虫、5龄幼虫、雄成虫、初羽未交尾雌成虫、交
尾后怀卵雌成虫，提取各虫态或龄期RNA。根据CDS序列设计引物和内参基因见表1。使用
50 μL PCR体系反应，在90 ℃下持续35 s， 随后以95 ℃持续10 s，以65 ℃持续30 s，60～
90 ℃以0.5 ℃递增5 s的40个循环生成熔解曲线。每个反应进行3次重复，基因表达量利用2-
ΔΔCt方法计算[ 12 ]。使用统计学软件SPSS19.0分析基因在各样品中相对表达水平，利用单因
素方差（AVOVA）进行多重比较分析基因相对表达量的差异显著性水平（P<0.05）。
2 结果与分析
2. 1 AgRpS8基因序列分析
AgRpS8基因开放阅读框ORF区长度627 pb，编码208个氨基酸，无跨膜螺旋区，N端没
有信号肽，该蛋白属于无跨膜螺旋及信号肽结构蛋白（图1）。经在线软件 ExPASy预测，
AgRpS8基因等电点（Pl）为5.21，分子量（Mw）为49.992KDa。经Hphob 方法分析，
AgRpS8基因序列中，疏水性第121位氨基酸为Hydropathy Score 最高值3.87，第21位氨基酸
为Hydropathy Score 最小值-4.07（图2）。
AgRpS8基因保守结构域预测为PTZ00148超级家族40S核糖体蛋白S8（40S ribosomal
protein S8），其中长度1-618pb与其一致，E-value值1.18e-115（图3）。从AgRpS8中发现
了6个p-value 值较高的Motif结构，为核糖体蛋白家族中常见的保守的结构特点（图4）。通
过BlastP同源性及序列比对结果表明，与AgRpS8同源性排列前三的核糖体蛋白基因依次为：
意大利蜜蜂（Apis mellifera） AmRpS8基因，同源性为87.02%;草地贪夜蛾（Spodoptera
frugiperda）SfRpS8基因，同源性为83.65%;果蝇（Drosophila melanogaster）DmRpS8基因，同
源性为78.37%（图4）。
进一步与其他昆虫核糖体蛋白RpS8建立系统发育树（图6），分析表明，光肩星天牛
AgRpS8与赤拟谷盗的2个核糖体蛋白（TcRpS8-like、TcRpS8）聚集在同一个分支上，表明光
肩星天牛AgRpS8核糖体蛋白与赤拟谷盗的2个核糖体蛋白可能具有类似的功能，亲缘性接
近。
2. 2 AgRpS8基因的时空表达特征
通过pMD18-T载体设计AgRpS8基因的引物，选取引物酶切点XbaI和XmaI（图7），结
果显示，核糖体蛋白基因AgRpS8的相对表达量在光肩星天牛不同发育阶段均有一定量的表
达，在幼虫1～ 2龄期，3～4龄期，5龄期相对表达量较平稳;而在光肩星天牛成虫期相对表达
量较低;但在光肩星天牛雌虫交配后怀卵的发育阶段相对表达量达到最高值2.46，显著高于其
他发育阶段（P<0.05）（图8）。
图6 AgRpS8与其它昆虫RpS8的系统发育树
注：分支上数字代表分支长度，分支颜色表示基于1 000次重复的bootstrap值。绘制系统
发育树的其它昆虫：果蝇（Dm），赤拟谷盗（（Tc），草地贪夜蛾（Sf），意大利蜜蜂
（Am）
图7 pMD18-T载体酶切点
图8 AgRpS8基因在光肩星天牛
不同发育阶段相对表达量
注：1～2 a，幼虫1～2龄期;3～4 a，幼虫3～4龄期;5 a，5龄期;M，光肩星天牛雄性成
虫;VF，处女的雌性光肩星天牛成虫;GF，怀孕的雌性光肩星天牛成虫。小写字母代表AgRpS8
基因相对表达量在不同发育阶段的显著水平（P<0.05）
3 结论与讨论
昆虫体内的核糖体对于维持其正常的生命活动和调控昆虫的生长发育起着关键作用[ 13 -
15 ]。CDK11家族蛋白在细胞增殖和分化过程中发挥有重要的作用，RpS8作为一类核糖体亚
基蛋白，参与调控分泌及代谢途径[ 3 - 5 ]。本研究解析了光肩星天牛核糖体蛋白AglaRpS8基
因序列结构，理化性质和功能特征，在基础上通过基因保守结构域及系统发育分析，
AglaRpS8基因与鞘翅目赤拟谷盗核糖体蛋白TcRpS8和TcRpS8-like在结构与功能上可能存在
相似的作用。
核糖體蛋白AgRpS8在光肩星天牛不同发育阶段均有不同程度的表达，在幼虫1～5龄期
表达量较高，在雄性光肩星天牛成虫和雌性未交配的光肩星天牛成虫中表达量降低，而在交配
后怀卵的雌性光肩星天牛成虫中表达量达到最高值。这一结果表明，核糖体蛋白AgRpS8基因
可能参与光肩星天牛雌虫孕育过程中细胞的增殖和蛋白质合成。本研究初步解析了核糖体蛋白
基因AgRpS8在光肩星天牛不同发育阶段的表达规律，对可能发挥的功能进行了预测，但未进
行验证，是否发挥有其他生理功能作用也尚不明确，因此，有待进一步开展AgRpS8基因的生
理机制及相关代谢通路的研究。
参考文献
[1] 廖昌敏， 张咏祀， 刘小红， 等. 水杉40S核糖体蛋白S8基因的克隆及生物信息学分
析[J]. 分子植物雨中，2020，18（21）：7 008 - 7 014.
[2] Tian Z.C.， Liu G.Y.， Yin H.， et al. RPS8—a new informative DNA marker for
phylogeny of Babesia and Theileria parasites in China[J]. PLoSONE， 2013， 8（11）： e79860.
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