2024年5月6日发(作者：)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(21)申请号 CN2.5
(22)申请日 2014.07.04
(71)申请人 杨承刚
地址 100080 北京市海淀区善缘街1号2层3-103
(72)发明人 杨承刚 宋宏涛 边洋 孙耀兰
(74)专利代理机构
代理人
(51)
C12Q1/68
权利要求说明书 说明书 幅图
(10)申请公布号 CN 104059984 A
(43)申请公布日 2014.09.24
(54)发明名称
胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒及
CR2基因在其制备中的用途
(57)摘要
本发明公开了CR2基因在制备诊断
胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒中的用途。
本发明利用高通量测序技术筛选出CR2基
因在胆囊结石中表达下调，在胆囊息肉中
表达上调，并使用荧光实时定量PCR方法
验证了上述结论，据此，本发明还公开了
一种诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒以
及利用该试剂盒诊断胆囊结石和胆囊息肉
的方法。本发明一方面为研究胆囊息肉和
胆囊结石的分子机理提供新的思路，另一
方面为早期诊断胆囊结石和胆囊息肉提供
了更为灵敏的诊断试剂盒。
法律状态
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
权 利 要 求 说 明 书
2基因在制备诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒中的用途，其特征在于，所述
诊断试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增CR2基因和管家基
因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、
SYBR Green荧光染料。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述扩增CR2基因的引物对的序列如
下：正向序列5’-TCTAATATCAGCAAGTCTCT-3’，反向序列5’-
TTCAGGCATCTCATAAGT-3’；所述管家基因是GAPDH，扩增GAPDH基因的引
物对的序列如下：正向序列5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’，反向序列5’-
GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PCR缓冲液包含：25mMKCL、
2.5mM MgCL2、
200mM(NH4)2SO4。
还包含M-MLV逆转录体系和/或RNA提取试剂；所述逆转录体系包含：T重复寡
核苷酸Oligo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；所
述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述逆转录反应液包含：250mM
PH8.3Tris-HCL、375mM KCL、15mM MgCL2、50mM>2、
200mM(NH4)2SO4。
试剂盒还包含M-MLV逆转录体系和/或RNA提取试剂；所述逆转录体系包含：T
重复寡核苷酸Oligo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、
dNTPs；所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
10.根据权利要求9所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述逆转录反应液包含：
250mM PH8.3Tris-HCL、375mM KCL、15mM MgCL2、50mM DTT。
说 明 书
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒以及CR2基
因在制备胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒中的用途。
背景技术
胆囊结石是指发生在胆囊内的结石所引起的疾病，是一种常见病。随年龄增长，发
病率也逐渐升高，女性明显多于男性。随着生活水平的提高，饮食习惯的改变，卫
生条件的改善，我国的胆石症已由以胆管的胆色素结石为主逐渐转变为以胆囊胆固
醇结石为主。胆囊结石与多种因素有关，任何影响胆固醇与胆汁酸浓度比例改变和
造成胆汁淤滞的因素都能导致结石形成。个别地区和种族的居民、女性激素、肥胖、
妊娠、高脂肪饮食、长期肠外营养、糖尿病、高脂血症、胃切除或胃肠吻合手术后、
回肠末段疾病和回肠切除术后、肝硬化、溶血性贫血等因素都可引起胆囊结石。在
我国西北地区的胆囊结石发病率相对较高，可能与饮食习惯有关。
胆囊息肉又称为胆囊息肉样病变，是各种胆囊粘膜良性隆起的简称，泛指向胆囊腔
突起或隆起的病变，可以是球形或半球形，有蒂或无蒂，多为良性，包括已知的胆
囊腺瘤，胆固醇沉着症，胆囊腺肌增生症，炎症性肉芽肿等，发病原因不明，可能
与慢性胆囊炎有关。病理上表现为胆囊壁某种组织或细胞成份过度增生，既非炎症，
也非肿瘤，B超回声表现和息肉相同，故称胆囊息肉样病变，习称胆囊息肉，因直
径≥10mm时有恶变倾向，被列为十大癌前病变之一。因症状轻微，所以该病常常
造成患者延误。
高通量转录组测序(RNA-sep)是在转录组水平上进行深度测序的一项技术，测序技
术在转录组分析中的应用主要集中在基因表达谱的构建，新基因的发现、小分子非
编码RNA表达谱的构建和新小分子RNA基因的发现、蛋白质编码基因注释、以
及如fusion transcript等转录组研究上。数据在最初的处理上是大体是相似的，接下
来针对不同的研究目的可以选用不同的生物信息学软件进行计算。
利用大规模测序技术直接对由mRNA反转录成的cDNA序列进行测序，产生数以
千万计的reads数量，从而使得一段特殊的基因组区域的转录水平可以直接通过比
对到该基因组区域的reads数来衡量。该技术常用来构建某一特定组织或细胞的基
因表达谱，通过对正常组织和病变组织进行基因表达谱的分析，得到在两种组织中
差异表达的基因，一方面为研究疾病的发生和发展的分子机制提供新的思路，另一
方面为疾病的诊断和治疗提供新的诊断标志物或药物靶点。
发明内容
本发明利用高通量测序技术发现CR2基因在胆囊结石和胆囊息肉中的表达较正常
组织存在差异，与正常组织相比，CR2基因在胆囊结石中表达下调，而在胆囊息
肉中表达上调，通过检测CR2基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患
有胆囊结石和胆囊息肉。
本发明的目的在于提供CR2基因在制备诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒中的用
途。所述诊断试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增CR2基因
和管家基因的引物对。所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、
dNTPs、SYBR Green荧光染料。
上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，
所述PCR缓冲液包含：25mM KCL，2.5mM MgCL2，
200mM(NH4)2SO4。
所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；在优选的实
施方案中，扩增CR2基因的正向引物序列为5’-TCTAATATCAGCAAGTCTCT-3’，
反向引物序列为5’-TTCAGGCATCTCATAAGT-3’；管家基因优选GAPDH，扩增
该基因的正向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’，反向引物序列为
5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T
重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、
dNTPs。
优选逆转录反应液包含：250mM Tris-HCL(PH8.3)、375mM KCL、
15mMMgCL2、50mM>
RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA
酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA提取试剂包含Trizol、
氯仿、异丙醇、75％乙醇。
本发明的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明的另一目的在于提供一种诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒。所述诊断试剂
盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增CR2基因和管家基因GAPDH
的引物对。所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、
SYBR Green荧光染料。
上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，
所述PCR缓冲液包含：25mM KCl，2.5mM MgCL2，
200mM(NH4)2SO4。
所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；优选的实施
方案中，扩增CR2基因的正向引物序列为5’-TCTAATATCAGCAAGTCTCT-3’，
反向引物序列为5’-TTCAGGCATCTCATAAGT-3’；管家基因优选GAPDH，扩增
该基因的正向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’，反向引物序列为
5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T
重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、
dNTPs。
优选逆转录反应液包含：250mM Tris-HCL(PH8.3)、375mM KCL、
15mMMgCL2、50mM>
RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA
酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA提取试剂包含Trizol、
氯仿、异丙醇、75％乙醇。
本发明的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明还提供了利用上述诊断试剂盒诊断胆囊结石和胆囊息肉的方法，所述方法包
括：
(1)提取样本总RNA；
(2)将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；
(3)在荧光实时定量PCR仪上将CR2基因和管家基因进行扩增检测；
(4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量；
(5)CR2基因表达下调，表明研究对象为胆囊结石患者；CR2基因表达上调，表明
研究对象为胆囊息肉患者。
步骤(1)的具体实施方法为：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的
研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5min；
②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；
③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不
要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充
分颠倒混匀，置于冰上10min；
④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％
DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心
5min；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解
沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
步骤(2)的具体实施方法为：用逆转录缓冲液对1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。
采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加
入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，
30ummol/l Oligo(dT)，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短
暂离心。
步骤(3)的具体实施方法为：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有
扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBRGreen
聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板
cDNA2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，
(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler
荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增CR2基因的正向引物序列为5’-
TCTAATATCAGCAAGTCTCT-3’，反向引物序列为5’-
TTCAGGCATCTCATAAGT-3’；扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-
CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’，反向引物序列为5’-
GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
本发明的优点和有益效果在于：(1)本发明首次公开了CR2基因与胆囊息肉和胆囊
结石相关，CR2基因有望成为诊断胆囊息肉和胆囊结石的分子标志物，同时为研
究胆囊息肉和胆囊结石的分子机理提供新的思路。(2)利用检测基因表达的方式诊
断胆囊结石和胆囊息肉的存在与否的方法较现有技术中使用B超检测的方法更加
灵敏，有利于疾病早期的诊断。
附图说明：
图1显示荧光实时定量PCR测定正常组织、胆囊息肉和胆囊结石中CR2基因
mRNA的相对表达量。
具体的实施方式：
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并
不意味着限制本发明的保护范围。
实施例1筛选与胆囊息肉和胆囊结石相关的基因
1.1样品收集
各收集60例正常组织、患胆囊结石的组织、患胆囊息肉的组织，每组中20个样本。
1.2RNA样品的制备及质量分析
1.2.1RNA样品的制备
三组样品包括胆囊息肉组织、胆囊结石组织、正常组织，经过RNA抽提后经琼脂
糖凝胶电泳判断RNA样品质量，合格者可以用于进一步的转录组分析。
1.2.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：
OD260/OD280为1.8-2.2。
1.2.3RNA样品的质量分析(Agilent Technologies2100Bioanalyzer)
Agilent Technologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S
rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq
测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
1.3高通量转录组测序
1.3.1RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与
s参考基因组(hg19)进行匹配，s UCSC hg19版的预先构建的
索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允
许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域
和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基
因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
1.3.2转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cuffiinks v1.0.3处理，Cuffiinks v1.0.3将RNA-seq片段数目
进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特
定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值
的置信区间。Cuffiinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载
(Homo_)。
1.3.3差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，
Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测
差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差
异表达。
1.4结果
前期的RNA-seq测序结果发现只有7个基因在胆囊结石中下调同时在胆囊息肉中
上调，其中有2个基因为长片段非编码RNA，1个基因为假基因，查阅文献发现
目前还没有关于以上基因与胆囊结石和胆囊息肉的报道。
实施例2QPCR验证候选基因与胆囊结石和胆囊息肉的关系
基于前期高通量转录组深度测序的结果，根据P value的大小，我们选择CR2基因
(其表达在胆囊结石中下调，且在胆囊息肉中上调)进行验证。收集20对胆囊息肉
和胆囊结石组织样本同时收集20个正常组织样本，采用荧光实时定量PCR进行经
典的分子生物学实验验证(qRT-PCR)，具体操作步骤如下所示：
(1)RNA提取
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本
成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5min;
②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min;
③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不
要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充
分颠倒混匀，置于冰上10min；
④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％
DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心
5min；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解
沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
(2)逆转录
用逆转录缓冲液对1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个
样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，
5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30mmol/l Oligo dT，200U/μl
M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
(3)QPCR扩增检验
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以
保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，
正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水8.5μl；扩
增CR2基因的正向引物序列为5’-TCTAATATCAGCAAGTCTCT-3’，反向引物序
列为5’-TTCAGGCATCTCATAAGT-3’；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正
向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’，反向引物序列为5’-
GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：
95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在
Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定
目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，结果如图1所示，与正常组织相比，CR2基因
在胆囊结石中下调，在胆囊息肉中上调，同RNA-sep结果一致。
实施例3胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒的制备
根据CR2基因与胆囊结石和胆囊息肉的相关性，可以通过检测CR2基因的表达情
况来诊断胆囊结石和胆囊息肉是否发生，据此本发明提供了一种基于检测CR2基
因表达来诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBR
Green聚合酶链式反应体系；扩增CR2基因和GAPDH基因的引物对。扩增CR2
基因的正向引物序列为5’-TCTAATATCAGCAAGTCTCT-3’，反向引物序列为5’-
TTCAGGCATCTCATAAGT-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-
CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’，反向引物序列为5’-
GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓
冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液成分为：25mM KCL，2.5mM
MgCL2、200mM(NH4)2SO4。
实施例4胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒的制备
根据CR2基因与胆囊结石和胆囊息肉的相关性，可以通过检测CR2基因的表达情
况来诊断胆囊结石和胆囊息肉是否发生，据此本发明提供了一种基于检测CR2基
因表达来诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBR
Green聚合酶链式反应体系、扩增CR2基因和GAPDH基因的引物对、M-MLV逆
转录体系。扩增CR2基因的正向引物序列为5’-TCTAATATCAGCAAGTCTCT-3’，
反向引物序列为5’-TTCAGGCATCTCATAAGT-3’；扩增GAPDH的正向引物序列
为5，-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’，反向引物序列为5，-
GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓
冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mM KCL、2.5mM
MgCL2、200mM(NH4)2SO4。
M-MLV逆转录体系组分为：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV
逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。逆转录反应液组分为：250mM>2、
50mM的DTT。RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白
酶。
实施例5胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒的制备
根据CR2基因与胆囊结石和胆囊息肉的相关性，可以通过检测CR2基因的表达情
况来诊断胆囊结石和胆囊息肉是否发生，据此本发明提供了一种基于检测CR2基
因表达来诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBR
Green聚合酶链式反应体系、扩增CR2基因和GAPDH基因的引物对、RNA提取
试剂。扩增CR2基因的正向引物序列为5’-TCTAATATCAGCAAGTCTCT-3’，反
向引物序列为5’-TTCAGGCATCTCATAAGT-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为
5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’，反向引物序列为5’-
GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓
冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mM KCL、2.5mM
MgCL2、200mM(NH4)2SO4。
RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
实施例6胆囊结石和胆囊息肉诊断试剂盒的制备
根据CR2基因与胆囊结石和胆囊息肉的相关性，可以通过检测CR2基因的表达情
况来诊断胆囊结石和胆囊息肉是否发生，据此本发明提供了一种基于检测CR2基
因表达来诊断胆囊结石和胆囊息肉的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBR
Green聚合酶链式反应体系、扩增CR2基因和GAPDH基因的引物对、M-MLV逆
转录体系、RNA提取试剂。扩增CR2基因的正向引物序列为5’-
TCTAATATCAGCAAGTCTCT-3’，反向引物序列为5’-
TTCAGGCATCTCATAAGT-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-
CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’，反向引物序列为5’-
GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓
冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mM KCL、2.5mM
MgCL2、200mM(NH4)2SO4。
M-MLV逆转录体系组分为：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV
逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。逆转录反应液组分为：250mM>2，
50mMDTT。RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领
域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干
改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
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