2024年4月28日发(作者:)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号
CN 108342368 A
(43)申请公布日
2018.07.31
(21)申请号 2.8
(22)申请日 2018.01.25
(71)申请人 武汉珈创生物技术股份有限公司
地址 430075 湖北省武汉市东湖开发区高
新大道666号武汉国家生物产业基地
项目B、C、D区研发楼B1栋
(72)发明人 袁冰 李姣 丛娜 刘传桂
(74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限
公司 11228
代理人 程殿军 张瑾
(51).
C12N
7/06
(2006.01)
C12Q
1/70
(2006.01)
C12Q
1/6851
(2018.01)
C12Q
1/18
(2006.01)
权利要求书3页 说明书12页 附图2页
C12R
1/93
(2006.01)
C
N
1
0
8
3
4
2
3
6
8
A
(54)发明名称
一种低pH孵育病毒灭活的验证方法
(57)摘要
本发明涉及一种低pH孵育灭活病毒的验证
方法,选择指示病毒及其对应的宿主细胞;指示
病毒扩增和纯化;病毒工作原液和样品的滴度测
定;灭活病毒验证实验pH值的优化;低pH值孵育
灭活病毒效果评估。本发明所提供的方法,能实
现实验室摸拟基因工程药物生产工艺病毒灭活
的全过程,优化了指示病毒的扩增、纯化工艺,使
指示病毒工作原液滴度提高,pH值统一到7.0,质
量稳定而益于后续操作,同时优化了低pH孵育的
具体技术细节(如最优孵育pH值的确定,pH调节
方式的优化等),提高对常见的DNA病毒、RNA病
毒、有包膜病毒和无包膜病毒灭活的有效性和实
效性。
CN 108342368 A
权 利 要 求 书
1/3页
1.一种低pH孵育灭活病毒的验证方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)选择指示病毒及其对应的宿主细胞:选择伪狂犬病毒、鼠白血病病毒、水疱性口炎病
毒、猪细小病毒为指示病毒;选择指示病毒相对应的宿主细胞,伪狂犬病毒对应的为猪肾细
胞,鼠白血病病毒对应的为猫星型细胞,水疱性口炎病毒对应的为非洲绿猴肾细胞细胞,猪
细小病毒对应的为猪肾细胞;
2)指示病毒扩增和纯化:常规扩增收样后超速离心换用新鲜无血清MEM培养基溶解,使
其病毒滴度提高,pH值统一为7.0;
3)病毒工作原液和样品的滴度测定:采用TCID
50
法或实时荧光定量RT-PCR法进行滴度
测定;
4)灭活病毒验证实验pH值的优化:通过预实验确定了指示病毒最优的孵育pH以及pH值
的最佳调节方式;
5)低pH值孵育灭活病毒效果评估:用阳牲对照的病毒滴度减去实时取样样品中的病毒
滴度,获得不同取样时间点的病毒灭活定量数据(LRV,log/ml),若该时间点的LRV≥4,则低
pH孵育该时间的灭活工艺灭活病毒有效。
2.如权利要求1所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法,其特征在于,步骤2)所述指示病
毒的扩增和纯化具体包括如下步骤:
将各宿主细胞分别接种在含有10%(v/v)FBS的MEM培养基的T75细胞培养瓶中,放置于
37℃,5%CO
2
培养箱中培养;
当宿主细胞汇合度达到80%-90%时,弃掉细胞上清,加入10
-4
-10
-1
稀释度的相应病毒
液3ml,37℃吸附1~2h;
吸附结束后,弃掉病毒液于巴氏液中,用无血清的MEM培养基清洗细胞一遍,再用含有
2%(v/v)FBS的MEM培养基培养36-48h左右,当宿主细胞发生80%以上严重病变(CPE)但没
有完全病变漂浮时,对细胞进行破碎,4℃3000g离心10min去除细胞碎片,收集上清,再用
0.22μm滤器过滤后即为无菌的病毒种子原液;
取上述上清4℃,72,000g超速离心4h后,弃上清,沉淀用超速离心前原体积的1/5-1/2
无血清MEM(pH=7.0)溶解,使得病毒工作原液的pH统一调节为7.0。
3.如权利要求2所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法,其特征在于,所述细胞的破碎方
法为:当宿主细胞发生80%以上严重病变(CPE)但没有完全病变漂浮时,将整个T75瓶子冻
入-70℃超低温冰箱,并在-70℃和37℃水浴反复冻融3次,每次冻融时间为30min-1h,且首
次-70℃冰箱过夜;或者将宿主细胞直接用超声波进行破碎。
4.如权利要求1所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法,其特征在于,其中步骤3)所述病
毒工作原液和样品的滴度测定具体包括如下步骤:
根据低pH孵育法病毒灭活验证实验的需求分装病毒工作原液,同时以1ml/支分装并进
行滴度测定;
对于CPE明显的病毒,采用TCID
50
法进行滴度测定,而对于CEP不明显或滴度不高的病
毒,采用实时荧光定量RT-PCR法测定滴度;
所述TCID
50
法测定病毒滴度时,参照Reed-Muench方法,计算工作原液或样品病毒
TCID
50
;
所述实时荧光定量RT-PCR法测定病毒滴度时,通过比对标准曲线获得样品结果相应
2
CN 108342368 A
权 利 要 求 书
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RNA拷贝数,以公式1000vRNA拷贝数/ml=1pfu感染性滴度/ml换算工作原液或样品病毒滴
度。
5.如权利要求4所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法,其特征在于,其中所述TCID
50
测
定法具体包括如下步骤:
细胞悬液制备:取宿主细胞T75瓶2-3瓶,弃上清液,每瓶加3ml,0.25%胰酶,37℃消化2
~5min,待细胞完全脱壁后加入6ml细胞生长培养基,充分分散细胞;取样显微计数,调整细
胞浓度为2×10
5
/ml备用;
细胞接种与培养:取96孔细胞培养板若干块,视测定病毒的种类接种制备好的宿主细
胞悬液,0.1ml/孔;细胞培养板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培养箱中培养24~36hr,当细胞长成
70%左右的单层即可用于病毒接种;
病毒稀释:将待测病毒液于3℃水浴锅迅速化冻后,在15ml无菌离心管内作连续10倍稀
释,即用2ml吸管吸或移液器取0.5ml病毒液,加到装有4.5ml MEM的第1支离心管内(10
-1
),
充分混匀后,更换吸管,吸取0.5ml加入第2支离心管内,连续如此操作,继续稀释,如此类
推,稀释到第8管(10
-8
);
病毒吸附:从CO
2
培养箱中取出96孔细胞板,弃上清液,用PBS或无血清MEM洗1次,于每孔
加入不同稀释度的病毒0.1ml,每稀释度重复8孔;细胞板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培养箱中
吸附1hr后,弃病毒液,每孔补加新鲜维持培养液0.1ml,继续培养;
病毒CPE观察:细胞培养板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培养箱中培养3~4天,记录细胞CPE状
况,参照Reed-Muench方法,计算样品病毒TCID
50
。
6.如权利要求4所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法,其特征在于,所述实时荧光定量
RT-PCR测定法具体包括如下步骤:
细胞悬液制备:取1个T25瓶宿主细胞,弃上清液,加1ml,0.25%(v/v)胰酶,37℃消化2
~5min,待细胞完全脱壁后加入3ml 10%(v/v)FBS的MEM细胞生长培养基,充分分散细胞;
取样显微计数,调整细胞浓度为2×10
5
/ml备用;
细胞接种与培养:取12孔细胞培养板若干块,视测定病毒的种类接种制备好的宿主细
胞悬液,1ml/孔;细胞培养板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培养箱中培养24~36hr,当细胞长成
60%~80%的汇合度即用于病毒接种;
病毒吸附:从CO
2
培养箱中取出12孔细胞板,弃上清液,用PBS或无血清MEM洗1次,于每孔
加入适宜稀释度的病毒原液(10
-1
或10
-2
)0.2ml,重复3孔;同时用MEM为阴性对照,操作同病
毒待测孔;细胞板置37℃,5%CO
2
的培养箱中吸附1hr后,弃病毒液,每孔补加新鲜维持培养
液1ml,继续培养;
病毒CPE观察及收样:细胞培养板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培养箱中培养3~4天;用倒置
显微镜观察CPE情况,出现CPE状况后即可收样;收集上清游离和贴壁的所有细胞,每孔细胞
用400μl TRIzol充分裂解后冻存于-20℃冰箱中;
样品RNA提取:使用InvitrogenReagent提取样品RNA;
逆转录反应:使用Promegea的M/MLV进行逆转录,合成cDNA第一链;
实时荧光定量:使用特异性引物探针和Premix EX Taq(qPCR)酶进行荧光定量反应,测
定病毒工作原液和样品的RNA拷贝数,根据公式1000vRNA拷贝数/ml=1pfu感染性滴度/ml
换算工作原液和样品病毒滴度。
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权 利 要 求 书
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7.如权利要求1所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法,其特征在于,其中在步骤2)之
后,步骤3)之前,还包括用10
-4
~10
-1
稀释度的病毒种子原液进行下一轮扩增得到指示病毒
工作原液的步骤。
8.如权利要求1所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法,其特征在于,步骤4)所述灭活病
毒验证实验pH值的优化具体包括:
水疱性口炎病毒在三种指示病毒中对低pH的耐受是最强的,选择其为该优化实验的指
示病毒,调节灭活样品的pH=3.0±0.1,3.5±0.1,4.0±0.1,4.5±0.1,5.0±0.1,并于37
℃±1℃水浴中保温15-60min,待样品溶液温度升至37℃±1℃时,按样品:病毒=9:1(v:v)
的比例加入VSV病毒,在18~25℃的室温下进行病毒灭活试验,分别在孵育0min,15min,
30min,60min和120min时取样,并测定各pH值及各时间点的样品病毒滴度;
优选地,所述水浴中保温的时间为30min。
9.如权利要求8所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法,其特征在于,所述灭活样品为加
入指示病毒的样品/病毒混合液。
10.如权利要求1所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法,其特征在于,步骤5)中所述阳
牲对照为病毒工作原液。
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说 明 书
一种低pH孵育病毒灭活的验证方法
1/12页
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域,具体的,本发明涉及一种用于基因工程药物/生物制品
生产工艺的低pH孵育病毒灭活的验证方法。
技术背景
[0002]
随着21世纪生物技术的发展,动物源性组织、细胞、体液及基因工程真核细胞表达
制备的生物制品逐渐增多,使用的人群不断扩大,加之动物源性产品原材料质量控制未引
起足够重视,生产工艺又基本没有经过严格的病毒去除/灭活效果验证。因此,目前动物源
性病毒感染人类的风险性极高,潜在病源性感染问题变得日益突出。其中动物组织来源制
品由于动物本身健康检疫状况差,不同动物携带的病毒外源因子复杂多变,可控性因素尚
不确定,对人体的潜在危害性较之经过系统鉴定和严格控制的基因工程真核细胞表达制品
的风险性更高。而基因工程生物制品由于其原材料也易受到病毒污染(如来源于人类、动物
的组织、血液、细胞等),其生产过程中使用或添加了可能含有外源病毒因子的材料(如动物
血清、胰酶等),产品原辅材料的病毒质量控制未引起足够重视等原因,其相关风险也不容
忽视。
[0003]
迄今,全球销售额最高的6类生物技术药物,分别是肿瘤治疗药物、抗肿瘤坏死因
子α药物、促红细胞生成素、胰岛素、β-干扰素和凝血因子。这6类生物药物除β-干扰素由大
肠杆菌和酵母表达外,其余5类都是经哺乳动物细胞表达生产。动物细胞大规模培养是当前
基因工程药物生产的主流方式。狂犬病毒、甲肝病毒等病毒灭活疫苗、乙型脑炎病毒等减毒
活疫苗的生产也都必须在动物细胞系中扩增毒种。由于细胞是具有生命属性的活生命体,
培养条件非常苛刻,生长周期比较长,易被无孔不入的微生物污染。尤其是细胞培养需加入
很多培养基质,如培养基、血清、生长因子等,这些基质多种多样,多来自人源、动物源材料,
使病毒潜在污染的风险明显增加。己证明血液制品中经常发现有HBV、HCV、HIV、HTLV等病毒
的污染。为了提高基因工程药品的生物安性,在基因工程药物/生物制品生产工艺中增加病
毒灭活步骤是必然趋势。
[0004]
根据《药品注册管理办法》的要求,由人的、动物的组织或者体液提取的制品、动物
源性单克隆抗体及真核细胞表达的重组制品,需增加病毒灭活工艺验证资料。因此国家食
品药品监督管理局和药品审评中心先后于2002年和2005年发布《血液制品去除/灭活病毒
技术方法及验证指导原则》和《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价
技术审评一般原则》,要求基因工程药物/生物制品生产工艺必须包含病毒去除/灭活的有
效工艺步骤,并对其方法和要点做了原则性的指导。其中,低pH孵育法就是一种有效的病毒
灭活/去除工艺,可用于血液制品和其他药物/生物制品生产中。但这两个指导文件并没有
对低pH孵育灭活病毒的验证实验的技术细节做出严格规格,尤其是pH的具体范围,检测参
数,评估体系;指示病毒的选择等。本发明就是针对基因工程药物/生物制品生产工艺中病
毒灭活与验证新技术的建立而提出的,具有实用性强,应用广泛的特点,建立了一套完备、
高效的低pH孵育病毒灭活与验证技术体系。
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说 明 书
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发明内容
[0005]
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种低pH孵育灭活病毒的验证方法。
[0006]
为了达成上述的目的,本发明提供一种低pH孵育灭活病毒的验证方法,包括以下
步骤:
[0007]
1)选择指示病毒及其对应的宿主细胞:选择伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,
PRV)、鼠白血病病毒(MuLV)、水疱性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus,VSV)、猪细小
病毒(Porcineparvovirus,PPV)为指示病毒;选择指示病毒相对应的宿主细胞,伪狂犬病毒
对应的为猪肾细胞(PK-15),鼠白血病病毒对应的为猫星型细胞(PG4),水疱性口炎病毒对
应的为非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞,猪细小病毒对应的为猪肾细胞(IBRS-2);
[0008]
2)指示病毒扩增和纯化:常规扩增收样后超速离心换用新鲜无血清MEM培养基溶
解,使其病毒滴度提高,pH值统一为7.0;
[0009]
3)病毒工作原液和样品的滴度测定:采用TCID
50
法或实时荧光定量RT-PCR法进行
滴度测定;
[0010]
4)灭活病毒验证实验pH值的优化:通过预实验确定了指示病毒最优的孵育pH以及
pH值的最佳调节方式;
[0011]
5)低pH值孵育灭活病毒效果评估:用阳牲对照的病毒滴度减去实时取样样品中的
病毒滴度,获得不同取样时间点的病毒灭活定量数据(LRV,log/ml),若该时间点的LRV≥4,
则低pH孵育该时间的灭活工艺灭活病毒有效。
[0012]
进一步地,其中步骤2)所述指示病毒的扩增和纯化具体包括如下步骤:
[0013]
将各宿主细胞分别接种在含有10%(v/v)FBS的MEM培养基的T75细胞培养瓶中,放
置于37℃,5%CO
2
培养箱中培养;
[0014]
当宿主细胞汇合度达到80%-90%时,弃掉细胞上清,加入10
-4
-10
-1
稀释度的相应
病毒液3ml,37℃吸附1~2h;
[0015]
吸附结束后,弃掉病毒液于巴氏液中,用无血清的MEM培养基清洗细胞一遍,再用
含有2%(v/v)FBS的MEM培养基培养36-48h左右,当宿主细胞发生80%以上严重病变(CPE)
但没有完全病变漂浮时,对细胞进行破碎,4℃3000g离心10min去除细胞碎片,收集上清,再
用0.22μm滤器过滤后即为无菌的病毒种子原液;
[0016]
取上述上清4℃,72,000g超速离心4h后,弃上清,沉淀用超速离心前原体积的1/5-
1/2无血清MEM(pH=7.0)溶解,使得病毒工作原液的pH统一调节为7.0。
[0017]
进一步地,其中所述细胞的破碎方法为:当宿主细胞发生80%以上严重病变(CPE)
但没有完全病变漂浮时,将整个T75瓶子冻入-70℃超低温冰箱,并在-70℃和37℃水浴反复
冻融3次,每次冻融时间为30min-1h,且首次-70℃水浴冻融过夜;或者将宿主细胞直接用超
声波进行破碎。
[0018]
进一步地,其中其中步骤3)所述病毒工作原液和样品的滴度测定具体包括如下步
骤:
[0019]
根据低pH孵育法病毒灭活验证实验的需求分装病毒工作原液,同时以1ml/支分装
并进行滴度测定;
[0020]
对于CPE明显的病毒,采用TCID
50
法进行滴度测定,而对于CEP不明显或滴度不高的
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病毒,采用实时荧光定量RT-PCR法测定滴度;
[0021]
所述TCID
50
法测定病毒滴度时,参照Reed-Muench方法,计算工作原液或样品病毒
TCID
50
;
[0022]
所述实时荧光定量RT-PCR法测定病毒滴度时,通过比对标准曲线获得样品结果相
应RNA拷贝数,以公式1000vRNA拷贝数/ml=1pfu感染性滴度/ml换算工作原液或样品病毒
滴度。
[0023]
进一步地,其中所述TCID
50
测定法具体包括如下步骤:
[0024]
细胞悬液制备:取宿主细胞T75瓶2-3瓶,弃上清液,每瓶加3ml,0.25%胰酶,37℃
消化2~5min,待细胞完全脱壁后加入6ml细胞生长培养基,充分分散细胞;取样显微计数,
调整细胞浓度为2×10
5
/ml备用;
[0025]
细胞接种与培养:取96孔细胞培养板若干块,视测定病毒的种类接种制备好的宿
主细胞悬液,0.1ml/孔;细胞培养板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培养箱中培养24~36hr,当细胞
长成70%左右的单层即可用于病毒接种;
[0026]
病毒稀释:将待测病毒液于3℃水浴锅迅速化冻后,在15ml无菌离心管内作连续10
倍稀释,即用2ml吸管吸或移液器取0.5ml病毒液,加到装有4.5mlMEM的第1支离心管内(10
-1
),充分混匀后,更换吸管,吸取0.5ml加入第2支离心管内,连续如此操作,继续稀释,如此
类推,稀释到第8管(10
-8
);
[0027]
病毒吸附:从CO
2
培养箱中取出96孔细胞板,弃上清液,用PBS或无血清MEM洗1次,
于每孔加入不同稀释度的病毒0.1ml,每稀释度重复8孔;细胞板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培
养箱中吸附1hr后,弃病毒液,每孔补加新鲜维持培养液0.1ml,继续培养;
[0028]
病毒CPE观察:细胞培养板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培养箱中培养3~4天,记录细胞
CPE状况,参照Reed-Muench方法,计算样品病毒TCID
50
。
[0029]
进一步地,其中所述实时荧光定量RT-PCR测定法具体包括如下步骤:
[0030]
细胞悬液制备:取1个T25瓶宿主细胞,弃上清液,加1ml,0.25%(v/v)胰酶,37℃消
化2~5min,待细胞完全脱壁后加入3ml10%(v/v)FBS的MEM细胞生长培养基,充分分散细
胞;取样显微计数,调整细胞浓度为2×10
5
/ml备用;
[0031]
细胞接种与培养:取12孔细胞培养板若干块,视测定病毒的种类接种制备好的宿
主细胞悬液,1ml/孔;细胞培养板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培养箱中培养24~36hr,当细胞长
成60%~80%的汇合度即用于病毒接种;
[0032]
病毒吸附:从CO
2
培养箱中取出12孔细胞板,弃上清液,用PBS或无血清MEM洗1次,
于每孔加入适宜稀释度的病毒原液(10
-1
或10
-2
)0.2ml,重复3孔;同时用MEM为阴性对照,操
作同病毒待测孔;细胞板置37℃,5%CO
2
的培养箱中吸附1hr后,弃病毒液,每孔补加新鲜维
持培养液1ml,继续培养;
[0033]
病毒CPE观察及收样:细胞培养板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培养箱中培养3~4天;用
倒置显微镜观察CPE情况,出现CPE状况后即可收样;收集上清游离和贴壁的所有细胞,每孔
细胞用400μlTRIzol充分裂解后冻存于-20℃冰箱中;
[0034]
[0035]
[0036]
样品RNA提取:使用InvitrogenReagent提取样品RNA;
逆转录反应:使用Promegea的M/MLV进行逆转录,合成cDNA第一链;
实时荧光定量:使用特异性引物探针和PremixEXTaq(qPCR)酶进行荧光定量反应,
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说 明 书
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测定病毒工作原液和样品的RNA拷贝数,根据公式1000vRNA拷贝数/ml=1pfu感染性滴度/
ml换算工作原液和样品病毒滴度。
[0037]
进一步地,其中在步骤2)之后,步骤3)之前,还包括用10
-4
~10
-1
稀释度的病毒种
子原液进行下一轮扩增得到指示病毒工作原液的步骤。
[0038]
进一步地,其中步骤4)所述灭活病毒验证实验pH值的优化具体包括:
[0039]
水疱性口炎病毒在三种指示病毒中对低pH的耐受是最强的,选择其为该优化实验
的指示病毒,调节灭活样品的pH=3.0±0.1,3.5±0.1,4.0±0.1,4.5±0.1,5.0±0.1,并
于37℃±1℃水浴中保温15-60min(优选30min),待样品溶液温度升至37℃±1℃时,按样
品:病毒=9:1(即总体系中加入了1/10的病毒工作原液)的比例(v:v)加入VSV病毒,在18~
25℃的室温下进行病毒灭活试验,分别在孵育0min,15min,30min,60min和120min时取样,
并测定各pH值及各时间点的样品病毒滴度。
[0040]
进一步地,其中所述灭活样品为加入指示病毒的样品/病毒混合液。
[0041]
进一步地,其中步骤5)中所述阳牲对照为病毒工作原液。
[0042]
本发明具有如下有益效果:
[0043]
1、本发明所提供的方法,能实现实验室摸拟基因工程药物生产工艺病毒灭活的全
过程,优化了指示病毒的扩增、纯化工艺,使指示病毒工作原液滴度提高,pH值统一到7.0,
质量稳定而益于后续操作,同时优化了低pH孵育的具体技术细节(如最优孵育pH值的确定,
pH调节方式的优化等),提高对常见的DNA病毒、RNA病毒、有包膜病毒和无包膜病毒灭活的
有效性和实效性。
[0044]
2、由于MuLV病毒是一种鼠源的逆转录病毒,可感染常用于基因工程药物/生物制
品生产的CHO工具细胞,该指示病毒毒株扩增滴度较低,不能运用常规方法(如TCID50)检
测;本发明建立的“病毒毒力实时荧光定量测定新技术”,不同于常规的病毒定量方法,具有
快速、高效、精确的特点,通过拷贝数换算后可精准测定MuLV病毒灭活前后样品的滴度,应
用于病毒灭活验证实验。同时,根据相应病毒设计引物探针后,该方法也可推广应用于其他
指示病毒的滴度测定。
附图说明
[0045]
图1为VSV各pH值孵育灭活速率的柱形图;
[0046]
图2为PRV低pH值孵育灭活速率的柱形图;
[0047]
图3为VSV低pH值孵育灭活速率的柱形图;
[0048]
图4为MuLV低pH值孵育灭活速率的柱形图。
具体实施方式
[0049]
下列实施例将进一步说明本发明的其它特征和优点,但该等实施例仅为示例而
用,并非对本发明的限制。
[0050]
下文所使用的材料或试剂若无特别说明,均为市售。
[0051]
本发明提供了一种低pH孵育灭活病毒的验证方法,其采取的具体技术方案如下:
[0052]
一、指示病毒的扩增、纯化和滴度测定
[0053]
选择伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)、鼠白血病病毒(MuLV)、水疱性口炎病
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毒(Vesicularstomatitisvirus,VSV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)为指示病毒
(均购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC))。其病毒属性见表1,涵盖了各种属和宿主的DNA
病毒,RNA病毒,有包膜病毒和无包膜病毒。
[0054]
表1.低pH孵育病毒灭活验证研究中的指示病毒
[0055]
1、指示病毒的扩增和纯化
[0057]
各病毒的扩增流程大致相同,选择指示病毒相对应的宿主细胞(均购自中国典型
培养物保藏中心(CCTCC)),如VSV为非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞,PRV为猪肾细胞(PK-15),
MuLV为猫星型细胞(PG4),猪细小病毒对应的为猪肾细胞(IBRS-2)。病毒增殖时,将各宿主
细胞接种在含有10%FBS的MEM培养基的T75细胞培养瓶中(一种宿主细胞对应一种病毒,分
别接种),放置于37℃5%CO
2
培养箱中培养。当细胞汇合度达到90%时,弃掉细胞上清,加入
适宜稀释度的各病毒液3ml,37℃吸附1~2h。吸附结束后,弃掉病毒液于巴氏液中(消毒处
理),用无血清的MEM培养基清洗细胞一遍,再用含有2%(v/v)FBS的MEM培养基培养36h左
右,当细胞发生80%以上严重病变(CPE)但没有完全病变漂浮(细胞漂浮由病毒CPE导致)
时,把整个T75瓶子冻入-70℃超低温冰箱,反复冻融3次(第一次可过夜冻存),也可直接用
超声波破碎,4℃3000g离心10min去除细胞碎片,收集上清,再用0.22μm滤器过滤后即为无
菌的病毒种子原液。病毒种子原液用1.5ml的无菌EP管分装,每管1ml置于超低温冰箱中长
期保存。
[0058]
而指示病毒工作原液则是用适当稀释的病毒种子原液进行下一轮扩增得到。由于
每种病毒收获时的pH不同,在进行低pH孵育时加入1/10体积对整个体系的影响也各不相
同,为了统一各病毒工作原液的pH并对病毒进一步纯化,提高病毒的纯度和质量,在4℃3,
000g离心10min去除细胞碎片后,取上清4℃72,000g超速离心4h后,弃上清,沉淀用超速离
心前原体积的1/2无血清MEM(pH=7.0)溶解(MuLV和PPV滴度较低,可用原体积1/5溶解),最
后根据低pH孵育法病毒灭活验证实验的需求分装病毒工作原液,同时分装1ml小支进行滴
度测定。
[0059]
2、指示病毒的滴度测定
[0060]
对于CPE明显的病毒,采用TCID
50
法进行滴度测定,而对于CEP不明显或滴度不高的
病毒(如MuLV),采用实时荧光定量RT-PCR法测定病毒工作原液滴度。其具体方法如下:
[0061]
2.1 TCID
50
测定法
[0062]
2.1.1细胞悬液制备:取宿主细胞T75瓶2-3瓶,弃上清液,每瓶加3ml0.25%胰酶,
37℃消化2~5min,待细胞完全脱壁后加入6ml含10%(v/v)FBS的MEM细胞生长培养基
(Gbico公司),充分分散细胞。取样显微计数,调整细胞浓度为2×10
5
/ml备用。
[0063]
2.1.2细胞接种与培养:取96孔细胞培养板若干块,视测定病毒的种类接种制备好
[0056]
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的宿主细胞悬液,0.1ml/孔。细胞培养板置37℃,5%CO
2
的培养箱中培养24~36hr,当细胞
长成70%左右的单层即可用于病毒接种。
[0064]
2.1.3病毒稀释:将待测病毒液于3℃水浴锅迅速化冻后,在15ml无菌离心管内作
连续10倍稀释,即用2ml吸管吸或移液器取0.5ml病毒液,加到装有4.5mlMEM的第1支离心管
内(10
-1
),充分混匀后,更换吸管,吸取0.5ml加入第2支离心管内,连续如此操作,继续稀释,
如此类推,稀释到第8管(10
-8
)。
[0065]
2.1.4病毒吸附:从CO
2
培养箱中取出96孔细胞板,弃上清液,用PBS或无血清MEM洗
1次,于每孔加入经10倍连续稀释(10
-1
-10
-2
….)的不同稀释度的病毒0.1ml,每稀释度重复
8孔。细胞板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培养箱中吸附1hr后,弃病毒液,每孔补加含2%(v/v)
FBS的新鲜MEM维持培养液0.1ml,继续培养。
[0066]
2.1.5病毒CPE观察:细胞培养板置37℃,5%CO
2
的培养箱中培养3~4天。用倒置显
微镜观察细胞病变情况,记录结果。
[0067]
2.2实时荧光定量RT-PCR测定法
[0068]
2.2.1细胞悬液制备:取1个T25瓶宿主细胞,弃上清液,加1ml0.25%胰酶,37℃消
化2~5min,待细胞完全脱壁后加入3ml含10%FBS的MEM细胞生长培养基,充分分散细胞。取
样显微计数,调整细胞浓度为2×10
5
/ml备用。
[0069]
2.2.2细胞接种与培养:取12孔细胞培养板若干块,视测定病毒的种类接种制备好
的宿主细胞悬液,1ml/孔。细胞培养板置37℃,5%CO
2
的培养箱中培养24~36hr,当细胞长
成70%左右的汇合度即可用于病毒接种。
[0070]
2.2.4病毒吸附:从CO
2
培养箱中取出12孔细胞板,弃上清液,用PBS或无血清MEM洗
1次,于每孔加入适宜稀释度的病毒原液(10
-1
或10
-2
)0.2ml,重复3孔。同时用MEM为阴性对
照,操作同病毒待测孔。细胞板置37℃,5%(v/v)CO
2
的培养箱中吸附1hr后,弃病毒液,每孔
补加含2%(v/v)FBS的MEM新鲜维持培养液1ml,继续培养。
[0071]
2.2.5病毒CPE观察及收样:细胞培养板置37℃,5%CO
2
的培养箱中培养3~4天。用
倒置显微镜观察CPE情况,出现CPE状况后即可收样。收集上清游离和贴壁的所有细胞,每孔
细胞用400μlTRIzol充分裂解后冻存于-20℃冰箱中。
[0072]
2.2.6样品RNA提取:使用InvitrogenReagent提取样品RNA。具体方法如
下:
a.胰酶消化细胞,1000r/min离心10min收集5*10
5
~5*10
6
细胞,用400μl Trizol充
分溶解细胞沉淀,转入新的无RNA酶的1.5mlEP管中,加入80μl氯仿(氯仿:Trizol=1:5)充
分混匀,剧烈震荡15秒,室温放置5min,使混匀的液体初步分层。
[0074]
b.样品放入冷冻离心机中4℃12000g离心15min,小心将上层取出移至新的无RNA
酶EP管,要避免吸到中间蛋白分层或下层氯仿溶液,宁可少取也不能多吸到其他成分。
[0075]
c.加入200μl预冷的异丙醇(异丙醇:Trizol=1:2),上下颠簸数次充分混匀,室温
(或者-20℃)静置沉淀10min。
[0076]
d.4℃12000g离心10min,小心吸掉上清,用预冷的75%的无水乙醇充分洗涤沉淀。
[0077]
e.4℃7500g离心5min,充分去除上清,将EP管倒置放在超净台里待沉淀接近完全
干燥(还没有完全干燥,沉淀颜色刚开始变成透亮)时,加入20μlRNase-freeWater溶解沉
淀。
[0073]
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[0078]
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f.60℃水浴10min以充分溶解RNA,用分光光度计Biophotemeter测定浓度后,迅速
将RNA放入超低温冰箱(-70℃冰箱)保存,备用进行后续试验。2.2.7逆转录反应:使用
Promegea的M/MLV进行逆转录,合成cDNA第一链。分两步进行,先加入反应体系:
[0079]
总RNA 1μg
[0080]
RP-MuLV(50μM) 1μl
[0081]
ddH
2
O 直至13μl
[0082]
充分混匀后70℃反应10min后快速置于冰上,再加入:
[0083]
[0084]
反应体系充分混匀后于37℃反应60min,结束后于70℃灭活5min,保存于-20℃以
供后续反应。
[0085]
2.2.8实时荧光定量
[0086]
PCR仪:美国Bio-Rad
[0087]
反应体系:20ul
[0088]
[0089]
反应条件:
[0090]
[0091]
实时荧光定量反应中所用到的引物、探针序列分别为:
[0092]
FP-MuLV:ACCTCTCATTGACCTTCT
[0093]
RP-MuLV:GGAATCTCAGAGTGGAG
[0094]
Q-MuLV探针:FAM-CTTCTCTGTCGCCATCTCCG-BHQ1
[0095]
应用TCID
50
法测定病毒滴度,则参照Reed-Muench方法,计算样品病毒TCID
50
。
[0096]
应用实时荧光定量RT-PCR法测定病毒滴度,则通过比对标准曲线获得样品结果相
应RNA拷贝数,以公式1000vRNA拷贝数/ml≈1pfu感染性滴度/ml换算样品病毒滴度。各批次
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指示病毒工作原液的滴度如表2所示,表明我们扩增、纯化的病毒滴度均>6log/ml,符合药
监局和审评中心文件的要求,可用于后续低pH孵育灭活病毒验证实验。
[0097]
表2.各批次病毒工作原液技术参数
[0098]
二、低pH孵育灭活指示病毒条件优化及验证实验效果
[0100]
1、灭活病毒验证实验pH值的优化
[0101]
该验证实验中,最核心的实验条件为样品和指示病毒混匀后的pH值。原理上pH值
越低,对病毒的灭活效果越好,但是在实际生物产业生产工艺中,许多生物制品可耐受的pH
值以及低pH孵育的时间是有一定限度的,必须在不影响基因工程药品/生物制品分子特性
和生物学功能的前提下进行病毒灭活工艺。因此,必须设计实验寻找一个pH值的上限,能确
保在一定的时间内灭活所有种类的指示病毒,以便根据不同样品的性质再选择最优的孵育
pH值方案。
[0102]
VSV病毒在三种指示病毒中对低pH的耐受是最强的,选择其为该优化实验的指示
病毒,调节灭活样品的pH=3.0±0.1,3.5±0.1,4.0±0.1,4.5±0.1,5.0±0.1,并于37℃
±1℃水浴中保温30min,待样品溶液温度升至37℃±1℃时,按样品:病毒=9:1加入VSV病
毒,在室温(18~25℃)进行基因工程药物生产工艺的病毒灭活试验,分别在孵育0min,
15min,30min,60min和120min时取样,并测定各pH值及各时间点的样品病毒滴度,其结果如
表3所示,0min取样的样品在混匀过程中已有病毒被灭活,因此可用VSV病毒工作原液的滴
度(log/ml)减去实时取样样品中的病毒滴度(log/ml),获得不同取样时间点的病毒灭活定
量数据(LRV,log/ml),据药监局和审评中心文件要求,当LRV≥4.0时,则该灭活工艺有效。
以取样时间为横座标,病毒滴度(log/ml)为纵座标,绘制VSV低pH孵育灭活速率的柱形图
(图1),结合表3和图1,当pH=3.0±0.1和pH=3.5±0.1时,孵育60min即可使LRV≥4.0,当
pH=4.0±0.1,则要孵育120min才能灭活有效。该数据对后续我们为客户定制实验方案具
有指导意义,即推荐样品的pH值最高控制在pH=4.0±0.1。
[0103]
表3.各孵育pH值对VSV病毒灭活效果
[0099]
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[0104]
2、pH值调节方法的优化
[0106]
由表3和图1的结果可知,即使是在刚刚加入指示病毒的0min,取样测定病毒的滴
度对比VSV工作原液都有一定程度的降低。在实际验证实验中,我们要确定的是最终样品加
入指示病毒后孵育时的pH值,由于生物样品低pH孵育的缓冲体系一般为甘氨酸或柠檬酸溶
液,缓冲能力较差,加入1/10的指示病毒(pH=7.0)必然使总体系的pH值升高,因此须在测
定加入病毒后的pH值再用调节剂调回指定的pH值,常规操作方式耗时耗力,0min的样品取
样也会受到影响,特别是对低pH敏感的PRV和MuLV病毒,会极大的影响测定结果。因此,我们
以样品为甘氨酸缓冲体系为例,在正式验证实验前加入一步pH值调节预实验,为保证结果
准确性,每批次样品重复三次实验,结果如表4所示:若预先调节样品的pH值低于设定的孵
育pH值约0.3~0.4,则加入1/10体积pH=7.0的病毒工作原液即可直接使总体系的pH值升
高至设定的pH值,在正式的验证实验时,则不需要再次测定并调节pH,从而节省了时间和操
作步骤,并把对0min样品的取样误差降到最低。
[0107]
表4.样品pH值调节预实验结果
[0108]
[0105]
样品体积
加入病毒前pH
加入病毒体积(pH=7.0)
低pH孵育总体积
样品1
18ml
3.0±0.1
2ml
20ml
样品2
18ml
2.7±0.1
2ml
20ml
样品3
18ml
3.5±0.1
2ml
20ml
3.8±0.1
样品4
18ml
3.2±0.1
2ml
20ml
3.5±0.1
样品5
18ml
4.0±0.1
2ml
20ml
4.4±0.1
样品6
18ml
3.6±0.1
2ml
20ml
4.0±0.1加入病毒后pH3.4±0.13.0±0.1
[0109]
3、低pH孵育灭活病毒验证实验效果
[0110]
亲和层析主峰样品低pH孵育(pH=3.7±0.1)灭活病毒工艺验证实验,选择PRV,
VSV和MuLV为指示病毒,PK15,Vero和PG4细胞为病毒宿主细胞。层析主峰样品取自生产过程
中,低pH孵育之前,18ml/批,于-20℃保存,试验前化冻,测定并调节其pH值至pH=3.4±
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0.1,并于2~8℃暂存备用。取样品9ml,加入三种1ml指示病毒工作原液,立即混匀,留样(取
样后加入Tris中和液调节pH=7.0),为0min样品。另取样品18ml,加入2ml指示三种病毒工
作原液,立即混匀,样品在18~25℃的生物安全P2级条件下的生物安全柜中放置>15h,其间
分别于15min、30min、60min、2h、3h、6h、12h和>15h留样(取样后加入Tris中和液调节pH=
7.0)。三批样品同等操作。所取样品中和至中性后存于-20℃备测。对以上样品进行病毒滴
度测定,每份样品重复测定两次。
[0111]
PRV和VSV滴度测定采用96孔培养板微量法,病毒感染宿主细胞后培养3天观察并
记录病毒致细胞病变程度,以Karber法计算病毒滴度(log/ml)评估灭活病毒效率。MuLV滴
度测定则采用实时荧光定量RT-PCR测定法,病毒感染宿主细胞后培养6天观察并记录病毒
致细胞病变程度,收样提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA第一链后,实时荧光定量测定病毒
滴度,通过比对标准曲线获得样品结果相应RNA拷贝数,以公式1000vRNA拷贝数/ml≈1pfu
感染性滴度/ml换算样品病毒滴度,并计算病毒滴度(log/ml)评估灭活病毒效率。病毒灭活
验证测试用三个批次的样品,设未处理的病毒工作原液作为阳性对照、酸中和液系统空白
对照(无病毒)、宿主细胞培养阴性对照。每项检测实验重复2次,每个稀释样品设8个重复
孔。验证检测结果分别见表5,表6和表7。
[0112]
检测低pH孵育(pH=3.7±0.1)0min、15min、30min、60min、2h、3h、6h、12h和>15h样
品的PRV病毒滴度(log/ml),因低pH孵育对PRV病毒的灭活迅速,0min取样的样品在混匀过
程中已有病毒被灭活,因此可用阳牲对照的病毒滴度(log/ml)减去实时取样样品中的病毒
滴度(log/ml),获得不同取样时间点的病毒灭活定量数据(LRV,log/ml),以取样时间为横
座标,病毒滴度(log/ml)为纵座标,绘制三种病毒灭活速率的柱形图(图2,图3和图4)。结果
表明,该亲和层析主峰样品低pH孵育(pH=3.7±0.1)的病毒灭活工艺为有效的灭活指示病
毒PRV、VSV和MuLV的方法。
[0113]
表5.低pH孵育灭活伪狂犬病毒(PRV)工艺验证检测结果
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表6.低pH孵育灭活水疱性口炎病毒(VSV)工艺验证检测结果
[0116]
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[0118]
表7.低pH孵育灭活鼠白血病病毒(MuLV)工艺验证检测结果
[0119]
[0120]
综上所述,以上所述仅为本发明的较佳实施例,并非因此而限制本发明的专利保
护范围,故举凡本发明说明书及附图所作等效变化等,皆应包括于本发明的保护范围内。
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图1
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