2024年4月28日发(作者：)
免疫球蛋白
所形成的抗体
和类似物。
分子与轻链免疫球蛋白分子(如κ轻链免疫球蛋白分子)的组合
分子，反之亦然；及其片段
在一个特定的实施方案中，使用常规的重组DNA技术，可以将一个或
多个本文中鉴定的CDR插入框架区。框架区可以是天然存在的或者是共有
框架区，优选是人框架区(参见例如Chothia et al.,.278:457-479
(1998)中人框架区的列表)。优选地，由框架区和CDR的组合生成的多核苷
酸编码特异性结合GD2的抗体。可以在框架区中进行一个或多个氨基酸取
代，并且优选地，所述氨基酸取代改善抗体对其抗原的结合。此外，此类方
法可用来取代或缺失一个或多个参与链间二硫键的可变区半胱氨酸残
生成缺少一个或多个链间二硫键的抗体分子。所述多核苷酸的
发明所涵盖并在本领域技术之内。
基，以
其他改变为本
完全人抗体对于人患者的治疗性处理而言是特别理想的。人抗体可以用
多种本领域已知的技术来制备，包括如上所述的噬菌体展示方法，使用源自
人免疫球蛋白序列的抗体文库。另参见美国专利第4,444,887和
以及PCT公开4,716,111号，
WO98/46645,WO98/60433,WO98/24893,WO98/16664,WO
使用其他技术产生但保留本发明的抗GD2抗体的可变区的人抗体是本
发明的一部分。人抗体还可以使用这样的转基因小鼠来产生，其不能表达功
能性的内源小鼠免疫球蛋白，但能够表达人免疫球蛋白基因。例如，
重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机导入或通过同源重组导
96/34096,WO96/33735,和WO91/10741；将上述每一文献全文通过引用并
入本文。Cole等人和Boerder等人的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole
et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan ,(1985);和
Boerner et al.,l.,147(1):86-95,(1991))。
可将人
入小鼠胚胎
恒定区和多
白基因座的同
干细胞。或者，除了人重链和轻链基因之外，可以将人可变区、
样性区导入小鼠胚胎干细胞。在通过同源重组导入人免疫球蛋
时或者分别地，可以使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因
JH区域的纯合缺失可阻止内源抗体产生。将经
显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后
纯合后代。用选定的抗原，例如本
免疫该转基因小鼠。可以从
得针对所述抗原的单
在B细胞分
变得无功能。尤其是，
过修饰的胚胎干细胞扩增后
繁殖嵌合小鼠来产生表达人抗体的
发明多肽的全部或一部分，按照正常方式
经过免疫的转基因小鼠使用常规的杂交瘤技术获
克隆抗体。该转基因小鼠所携带的人免疫球蛋白转基因
化过程中重排，然后经过类别转换和体细胞突变。由此，使用这
样的技术，能够产生治疗上有用的IgG,IgA,IgM和IgE抗体。
生人抗体的技术的概述可见
(1995)。关于该项技术用于
此类抗体的规程，可
关于这种产
Lonberg and Huszar,l.13:65-93
产生人抗体及人单克隆抗体的详细讨论以及产生
见例如PCT公开WO98/24893;WO92/01047;WO
专利第0598877号;美国专利第5,413,923;
96/34096;WO96/33735;欧洲
5,625,126;5,633,425;5,569,825;5,661,016;5,545,806;5,814,318;5,886,793;
5,916,771;和5,939,598号,本文通过提述并入其全部内容。此外，可接洽
Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.),Genpharm(San Jose,Calif.),和Medarex,Inc.
(Princeton,N.J.)等公司以使用与上文所述的相似方法提供针对选定抗原的人
抗体。
对移植有人外周血白细胞、脾细胞或骨髓的小鼠(例如XTL的三体瘤
(Trioma)技术)进行免疫也可以制造人MoAb。可以使用一种称为“引导选
择”(guided selection)的技术产生识别选定的表位的完全人抗体。在这种办法
中，使用选定的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，来引导选择识别相同表位
的完全人抗体(Jespers et al.,Bio/technology12:899-903(1988))。
如本文使用的，“抗GD2抗体”、“抗GD2抗体部分”或“抗GD2抗体片
免
段”和/或“抗GD2抗体变体”等等包括任何含有蛋白质或肽的分子，其包含
疫球蛋白的至少一部分，所述至少一部分含有源自任何本文中所述的
人源化单克隆抗体的重链或轻链或其配体结合部分的至少一个
(CDR)，以及与之组合的非鼠来源，优选人来源的、能够组入
中的重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区、框架区或
术语“抗GD2抗体”应合指或单独地指嵌合抗体
源化单克隆抗体hu3F8-H1L1-IgG1,hu3F8H1L2-
hu3F8-H2L2-IgG1,hu3F8-H1L1-IgG1n,hu3F8-
hu3F8-H1L1S,hu3F8-H3L3S,huH1-I-γ-1,huH3-I-γ-
以及它们的片段和区域。此类抗体能够在体外、
少、拮抗、轻减、缓解、阻断、抑制、消除、和
其中所述细胞表达GD2。作为非限制性
特定部分或片段可以高亲和力结合
嵌合或
互补决定区
本发明的抗体
其任何部分。或者，
ch3F8-IgG1,ch3F8-IgG4,人
IgG1,hu3F8H2L1-IgG1
H1L1-IgG4,hu3F8-H3L3,
1,hu3F8-IgG1-DEL抗体，
原位和/或在体内调节、减
/或干扰至少一种细胞功能，
实例，本发明的合适的抗GD2抗体、
人GD2表位。
术语“抗体”进一步意在涵盖抗体、消化片段、其特定部分和变体，包括
抗体模拟物或包含模拟抗体的结构和/或功能的抗体部分或其特定的片段或
部分，它们各自含有至少一个源自抗GD2抗体
合哺乳动物GD2的抗原结合片段。例如，
段，包括但不限于Fab(例如通过木瓜蛋
消化和部分还原)以及F(ab')2(例如通过胃
酶消化),pFc'(例如通过胃蛋白酶或纤溶酶
化、部分还原和再聚集),Fv或scFv(例如
明所涵盖(见例如
的CDR。功能性片段包括结
能够结合GD2或其部分的抗体片
白酶消化),Fab'(例如通过胃蛋白酶
蛋白酶消化),facb(例如通过纤溶
消化),Fd(例如通过胃蛋白酶消
通过分子生物学技术)片段，为本发
Colligan,Immunology,同上)。
可以片段可以通过本领域已知和/或如本文所述的酶切割、合成或重组
码
技术制备。还可以使用其中已经在天然终止位点的上游导入了一个或多个终
止密码子的抗体基因来产生多种截短形式的抗体。例如，可以设计编
F(ab')2重链部分的组合基因以包含编码重链的
列。抗体的不同部分可以通
工程技术制备为连续
CH1域和/或铰链区的DNA序
过常规技术化学连接在一起，或者可以使用基因
的蛋白质。
如本文中使用的，“嵌合”抗体或“人源化”抗体或“CDR嫁接的”包括本文
中描述的抗GD2Ab，或源自其的任何CDR，与源自非鼠抗体，优选人抗体
的一种或多种蛋白质或肽组合而成的任何组合。依照本发明，嵌合或人源化
抗体包括这样的抗体，其中诸CDR源自一种或多种本文所述的抗
而该抗体的至少一部分，或剩余部分源自一种或多种人抗体。
的人部分可包括在人体中基本上无免疫原性的框架、
GD2Ab，
因此，该抗体
CL、CH域(例如CH1、
CH2、CH3)、铰链、(VL、
人抗体
氨基酸
VH))区域。所述抗体的源自人抗体的部分不需要与
具有100%的同一性。在一个优选的实施方案中，保留尽可能多的人
残基以使得免疫原性可忽略，但对人残基可以视需要加以修饰，以支
持由CDR形成的抗原结合位点，同时使抗体的人源化最大化。相对于非修
饰的抗体，这样的变化或改变任选地并且优选地保留或减少在人体或其他物
种中的免疫原性。需要指出的是，人源化抗体可以由能够表达功能性
人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真
此外，当抗体是单链抗体时，其可包含在天然人抗体中
如，Fv可包含这样的接头肽，诸如2个至大约
基，优选8-15个甘氨酸或其他氨基酸残
可变区。这样的接头肽被认为是来
重排的
核细胞生成。
不出现的接头肽。例
20个甘氨酸或其他氨基酸残
基：其连接重链的可变区和轻链的
源于人的。
抗体人源化可以例如通过如下进行：合成组合文库，所述组合文库包含
非人目标单克隆抗体的6个CDR与各别的人框架池合
物。可以利用含有代表所有已知的重链和轻链人
以从所得的组合文库筛选对感兴趣抗原的
对亲本抗体的结合活性而言最有利
一步优化人源化抗体。
框融合而得到的融合
种系基因的人框架。然后可
结合。这种途径可容许选择就维持
的完全人框架。然后可以使用多种技术进
抗体人源化可以用来将小鼠或其他非人抗体进化为“完全人”抗体。所得
对于全长抗体分子，免疫球蛋白基因可以从杂交瘤细胞系的基因组
或mRNA获得。将抗体重链和轻链序列克隆到哺乳动物载体系统中。
的
通过双链序列分析来证实组装。抗体构建体可以在其他人或哺乳动物宿主细
胞系中表达。然后可以通过瞬时转染测定以及对表达的感兴趣的载体
Western印迹分析来证明构建体的正确性。使用快速测定方法可以分
选具有最高生产性的稳定细胞系。
DNA
的抗体仅含有人序列而没有小鼠或非人抗体序列，同时维持与起始抗体相似
的结合亲和力和特异性。
离和筛
至少一种本发明的抗GD2抗体可任选地由细胞系、混合细胞系、永生
化细胞或永生化细胞的克隆群体来产生，如本领域公知的。参见例如
Ausubel,
et al.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,
N.Y.(1987-2001);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,
Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Harlow and Lane,antibodies,
a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989).Colligan,et al.,eds.,
Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001);
Colligan et al.,Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,
N.Y.,(1997-2001),本文通过提述并入上述每一文献的全部内容。
根据一种途径，通过下述方式产生杂交瘤：将合适的永生细胞系与抗体
产生细胞融合，所述永生细胞系例如骨髓瘤细胞系，诸如但不限于Sp2/0,
Sp2/0-AG14,NSO,NS1,NS2,AE-1,L.5,>243,P3X63Ag8.653,Sp2SA3,Sp2
MAI,Sp2SS1,Sp2SA5,U937,MLA144,ACT IV,MOLT4,DA-1,JURKAT,
WEHI,K-562,COS,RAJI,NIH3T3,HL-60,MLA144,NAMAIWA,NEURO
2A)等等，或异源骨髓瘤(heteromylomas)，其融合产物，或源自其的任何细
胞或融合细胞，或本领域已知的任何其他合适的细胞系，参见例如
,等等；所述抗体产生细胞诸如但不限于分离
或克隆的脾、外周血、淋巴、扁桃体、或其他免
何其他表达重链或轻链恒定或可变或框架
异源核酸，作为重组或内源、病毒、细菌、
爬行动物、鱼类、哺乳动物、啮齿动物、
核、基因组DNA、cDNA、rDNA、
RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、
任何组合。参见例如
本文通过提述并入其
疫或含B细胞的细胞，或任
或CDR序列的细胞，作为内源或
藻类、原核、两栖动物、昆虫、
马、羊、山羊、绵羊、灵长类、真
线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或
单链、双链或三链的、杂交的等等，或其
Ausubel同上和Colligan,Immunology,同上，第2章，
全部内容。
任何其他合适的宿主细胞也可以用来表达编码本发明的抗体、其特定片
段或变体的异源或内源核酸。融合的细胞(杂交瘤)或重组可以细胞使用选择
性培养条件或其他合适的已知方法加以分离，并通过有限稀释或细胞分选或
其他已知方法进行克隆。产生具有期望的特异性的细胞可以通过合适
法(例如ELISA)来选择。 的测定
本发明的抗体还可以这样制备：使用至少一种编码抗GD2抗体的核酸
来提供在它们的乳汁中产生此类抗体的转基因动物或哺乳动物，诸如山羊、
牛、绵羊等。此类动物可以利用已知方法来提供。参见例如，但不限
于美国 专利第
5,304,489号5,827,690;5,849,992;4,873,316;5,849,992;5,994,616,5,565,362;
等，本文通过提述并入每一篇的全部内容。
本发明的抗体还可以这样制备：使用至少一种编码抗GD2抗体的核酸
来提供在植物部分或从其培养的细胞中产生此类抗体、特定部分或变体的转
基因植物和培养的植物细胞(例如但不限于烟草和玉米)。作为非限制
例，表达重组蛋白的转基因烟草叶已经被成功地用于提供大量
例如通过使用诱导型启动子。参见例如
Immunol.240:95-118(1999)及其中引用的
米来以产业生产水平表达哺乳动物
中产生者或从天然来源纯化
Biol.464:127-147(1999)及其
单链抗体(scFv))的转基因植
产了抗体。参见例如
用的参考文献。因此，
产生。还参见例如
性的实
的重组蛋白，
Cramer et al.,ol.
文献。此外，还已经使用转基因玉
蛋白质，其生物学活性与在其他重组系统
者等同。参见例如Hood et al.,.
中引用的参考文献。还已经从包含抗体片段(如
物种子(包括西红柿种子和马铃薯块茎)大量地生
Conrad et al.,Plant .38:101-109(1998)及其中引
本发明的抗体也可以根据已知方法施用转基因植物来
Fischer et al.,m.30:99-108(October,
1999),Ma et al.,Trends Biotechnol.13:522-7(1995);Ma et al.,Plant Physiol.
109:341-6(1995);Whitelam et al.,Biochem .22:940-944(1994)及
其中引用的参考文献。将上述每一篇文献通过提述完全并入本文。
抗GD2抗体可以使用公知方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述公
知方法包括但不限于蛋白A纯化、蛋白G纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽
提、阴离子或阳离子色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、
羟基磷灰石色谱和卵磷脂色谱。高效液相色谱("HPLC")也可用于纯
例如化。参见
Colligan,Current Protocols in Immunology,or Current Protocols in Protein
Science,John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如第1,4,6,8,9,和第
10章，本文通过提述并入每一篇的全部内容。
本发明的抗体包括天然纯化产物、化学合成程序产物、以及从真核宿主
通过重组技术产生的产物，所述真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆虫和
哺乳动物细胞。取决于重组产生程序中使用的宿主，本发明的抗体可
基化的或者非糖基化的，糖基化的是优选的。此类方法在多个
册中有说明，例如Sambrook(同上)第17.37-17.42节；
12,13,16,18和20章，Colligan,Protein Science(同
过提述并入所有上述文献的全部内容。
以是糖
标准实验室手
Ausubel(同上)，第10,
上)，第12-14章，本文通
纯化的抗体可以通过例如ELISA、ELISPOT、流式细胞术、
immunocytology、BiacoreTM分析、
SDS-PAGE和
功能测定法来
Sapidyne KinExATM动力学排除测定、
Western印迹，或者通过HPLC分析以及多种本文公开的其他
加以表征。
典型的哺乳动物表达载体包含：至少一个启动子元件，其介导mRNA
转录的起始；抗体编码序列；以及终止转录及对转录物进行聚腺苷酸化所要
求的信号。其他的元件包括增强子、Kozak序列、以及被RNA剪接
和受者序列所包夹的居间序列。用来自SV40的晚期和早期启
转录病毒例如RSV、HTLVI、HIVI的长末端重复
(CMV)的早期启动子，可以实现高效率的转录。
(例如人肌动蛋白启动子)。用于实施本发
如pIRES1neo、pRetro-Off、
Palo Alto、Calif.)、
(Invitrogen)、
的供者
动子、来自逆
(LTR)、以及巨细胞病毒
但是，也可以使用细胞元件
明的合适表达载体包括例如：载体
pRetro-On、PLXSN、或pLNCX(Clonetech Labs、
pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)
PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC
37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)。可
乳动物宿主细胞包括人Hela293、H9和Jurkat细胞，小鼠
细胞，Cos1、Cos7和CV1、鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L
巢(CHO)细胞。
以使用的哺
NIH3T3和C127
细胞和中华仓鼠卵
或者，基因可以在含有整合到染色体的该基因的稳定细胞系中表达。用
转染的基因也可以加以扩增以表达大量的被编码的抗体。DHFR(四氢
叶酸还原酶)标志物可用于开发携带数以百计甚至数以千计的感兴趣基因拷
贝的细胞系。另一种有用的选择标志物是酶谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy、et
al.，Biochem.J.227:277-279(1991);Bebbington、et al.、Bio/Technology
10:169-175(1992))。使用这些标记物，使哺乳动物细胞在选择培养基中生长，
并选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合到染色体中的经扩
因。中华仓鼠卵巢(CHO)及NSO细胞经常用于抗体的产生。
选择标志物如DHFR、GPT、新霉素或潮霉素共转染容许鉴定和分离经转染
的细胞。
增的基
依照本发明，抗GD2抗体包括ch3F8-IgG1、ch3F8-IgG4、 hu3F8-H1L1-
hu3F8-
hu3F8-
或这样
IgG1、hu3F8-H1L2-IgG1、hu3F8-H2L1-IgG1、hu3F8-H2L2-IgG1、
H1L1-IgG1n、hu3F8-H1L1-IgG4、hu3F8-H3L3、hu3F8-H1L1S、
H3L3S、huH1I-γ-1、huH3I-γ-1、hu3F8-IgG1-DEL抗体中的任一者，
的抗体：其中可变区或CDR源自ch3F8-IgG1、ch3F8-IgG4、 hu3F8-H1L1-
hu3F8-
hu3F8-
任一者，
的可变
hu3F8-
IgG1、hu3F8-H1L2-IgG1、hu3F8-H2L1-IgG1、hu3F8-H2L2-IgG1、
H1L1-IgG1n、hu3F8-H1L1-IgG4、hu3F8-H3L3、hu3F8-H1L1S、
H3L3S、huH1I-gamma1、huH3I-gamma1、hu3F8-IgG1-DEL抗体中的
且该抗体的框架区和恒定区源自一种或多种人抗体。源自所述抗体
区或CDR优选与ch3F8-IgG1、ch3F8-IgG4、hu3F8-H1L1-IgG1、
H1L2-IgG1、hu3F8-H2L1-IgG1、hu3F8-H2L2-IgG1、
hu3F8-H1L1-IgG4、hu3F8-H3L3、hu3F8-H1L1S、
hu3F8-H1L1-IgG1n、
hu3F8-H3L3S、
者的可变区或
变或来自人为
只要该
抗体的
huH1I-gamma1、huH3I-gamma1、hu3F8-IgG1-DE中的任一
CDR具有大约90%至大约100%的同一性，尽管来源于自然突
操作的任何及所有修饰，包括取代、插入和缺失均在考虑之内，
抗体保留结合GD2的能力。源自人抗体的嵌合、人源化或CDR嫁接
区域并不需要与人抗体具有100%同一性。在优选的实施方案中，尽
可能多地保持人氨基酸残基以使得免疫原性可忽略，但对于所
其是框架区的残基，根据需要并且如本文后面教导的那
代。本文中公开的此类修饰对于支持由CDR形
抗体的人源化最大化是必须的。
述人残基，尤
样依照本发明进行取
成的抗原结合位点，同时使
[138]与本文中描述的序列基本上相同的氨基酸序列包括包含保守氨基
氨
酸取代、以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸取代指将第一个氨
基酸替换成具有与该第一个氨基酸相似的化学和/或物理性质(例如电荷、结
构、极性、疏水性/亲水性)的第二个氨基酸。保守取代包括用下列各组之内
的一个氨基酸替换其他氨基酸：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬
酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸
氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨
酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨
和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
(T)、酪
酸(L)、异亮氨
酸(M)、半胱氨酸(C)
当然，技术人员要实施的氨基酸取代的数目取决于多种因素，包括上述
的那些。一般而言，对于任何给定的抗GD2抗体、片段或变体，氨基酸取
代、插入或缺失的数目不会多于40、30、20、19、18、17、16、15、14、
13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个，例如1-30个或者其中的
任何范围或数值，如本文中具体规定的。
本发明的抗GD2抗体中对功能而言必不可少的氨基酸可以通过本领域
已知的方法来鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如Ausubel，同上、
Chapters8、15;Cunningham and Wells、Science244:1081-1085(1989))。后一
种程序在分子中的每一个残基处导入单个丙氨酸突变。然后对所得的突变分
子测试生物学活性，包括但不限于至少对GD2的结合。对抗体结合
关键位点也可以通过结构分析诸如结晶、核磁共振或光亲和标
(Smith、et al.、.224:899-904(1992)and de Vos、et al.、
255:306-312(1992))。
而言的
记来鉴定
Science
抗GD2抗体可进一步任选地包含源自本文所述的至少一个序列的CDR
在一个实施方案中，免疫球蛋白链或其部分(例如可变区，CDR)的氨基
(例
酸序列与表1-4中的至少一个序列的氨基酸序列具有大约70-100%同一性
如70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、
86、87、88、89、90、91、92、93、
的任何范围或数值)。
的70-100%的连续氨基酸的至少一个的多肽。
84、85、
94、95、96、97、98、99、100或其中
本文中提供了示例性的重链和轻链可变区。本发明的抗体或其特定的变
体可包含来自本发明的抗体的任意数目的连续氨基酸残基，其中所述数目选
自由抗GD2抗体的连续残基数目的10-100%的整数。任选地，该连
酸的子序列的长度为大约10、20、30、40、50、60、70、80、
120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、
250或更多个氨基酸，或其中的任何范围或数值。此外，
可以是选自1-20的任何整数，例如至少2、3、4或5。
续氨基
90、100、110、
220、230、240、
此类子序列的数目
依照本发明，SEQ ID NO:11-22所示的核酸序列以及抗GD2抗体的可
重
变区(轻链和重链)的推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1-10。这些重链和轻
链可变区中的每一个均含有3个CDR，它们联合形成抗原结合位点。这3
个CDR被四个框架区包围，所述框架区主要发挥支持这些CDR的功能。
链和轻链的可变区序列中的CDR序列可以依照
Immunological Interest、4th ed.、
Services、
Sequences of Proteins of
United States Department of Health and Human
ment Printing Office、Washington、D.C中Kabat等人(1987)
编码本发明的人源化抗体、片段和区域的恒定(C)区的人类基因可以通
表
过已知方法从人胎肝文库获得。人C区基因可以从任何人细胞，包括那些
达并产生免疫球蛋白的细胞获得。人CH区可以从人H
或者同种型获得，包括γ、μ、α、δ、ε、及其亚
G4。由于H链同种型负责抗体的各种效应物功
望的效应物功能(诸如补体固定，
活性来引导。优选地，CH
一文通过计算机辅助比对来鉴别，或者通过对可变区的分子建模，例如利用
Levitt(1983).168:595所述的ENCAD程序来加以鉴别
链的任何已知的类别
型，诸如G1、G2、G3和
能，因此CH区的选择将由期
或者抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC))中的
区源自γ1(IgG1)或γ4(IgG4)。
人CL区可以从两种人L链同种型：κ或λ中任意一种获得，优选从κ
通过标准克隆技术(Sambrook、et al.(Molecular Cloning:A Laboratory
Manual、 Edition、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、
(1989)和Ausubel et al.、t Protocols in Molecular Biology
获得。
N.Y.
(1987-1993))从人细胞获得编码人免疫球蛋白C区的基因。人C区基因可以
从已知的含有呈现两类L链、五类H链、以及
得。 亚类的基因的克隆容易地获
抗体的可变区的序列可以通过插入、取代和缺失来修饰，以嵌合抗体维
持结合人GD2的能力为限。本领域普通技术人员可以通过实施如下所述的
功能测定来确定该活性的维持。可变区例如针对下文指明的可变区可具有大
约50%至大约100%同源性。在一个优选的实施方案中，所述抗体的
对下文指明的可变区具有大约80%至大约100%的同源性。在
实施方案中，所述可变区针对下文指明的可变区可具有
100%的同源性。
可变区
一个更优选的
大约90%至大约
在一个特定的实施方案中，本公开的优选的抗GD2Mab包含与本文中
优选地，本发明的抗体或其特定部分的抗体或抗原结合部分结合人
因此部分地或基本上中和一种GD2蛋白或片段，从而抑制通过GD2
活性。如本文所用的，术语“中和性抗体“指这样的抗体，其能够抑制
依赖性活性达约20-120%，优选至少约10、20、30、40、50、55、60、
如所述的，本发明还涉及这样的抗体、抗原结合片段、免疫球蛋白链和
CDR，其包含与本文中描述的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列中的氨基
酸。这样的抗GD2抗体可包括一个或多个来自自然突变或人工操作(如本文
具体说明的)氨基酸取代、缺失或添加。优选地，这样的抗体或抗原结合片
段以及包含此类链或CDR的抗体可以高亲和力结合人GD2。
65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%
或更多，依赖于测定法。抗GD2抗体抑制GD2依赖性活性的能力优选通过
至少一种如本文所述的或本领域已知的合适的测定法来评估。
GD2，
介导的
GD2
指明的序列具有95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同源性的可变轻
链区，并进一步包含与本文指明的序列具有95%、96%、97%、98%或99%
氨基酸序列同源性的可变重链区。
如本领域技术人员将会领会的，本发明包括本发明的至少一种生物学活
性抗体。生物学活性抗体具有天然(非合成)、内源或相关的和已知的抗体的
至少20%、30%、或40%，优选至少50%、60%、或70%，最优选至少
90%、或95%-100%的特异性活性。测定和定量酶活性和底物特异性
的方法是本领域技术人员公知的。
80%、
的度量
在另一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的人抗体和抗原结合片
段，其通过共价附接有机部分而被修饰。这样的修饰可
动学性质(例如增加的体内血清半衰期)的抗体或
以是线性或分枝的亲水性聚合物基团、脂
体的实施方案中，亲水性聚合物基
顿的分子量，并且可以是聚烷二醇
碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物
脂肪酸酯基团可包含约8至
以产生具有改善的药
抗原结合片段。有机部分可
肪酸基团、或脂肪酸酯基团。在具
团可以具有大约800至大约120,000道尔
(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、
或聚乙烯吡咯烷酮，并且所述脂肪酸或者
约40个碳原子。
本发明的修饰抗体及抗原结合部分可包含一个或多个直接或间接地共
价结合于该抗体的有机部分。每个与本发明的抗体或抗原结合片段键合的有
机部分可独立地为亲水性聚合物基团、脂肪酸基团、或脂肪酸酯基团。
文所用的，术语“脂肪酸”涵盖单羧基酸和双羧基酸。如本文中使用的，
“亲水性聚合物基团”指在水中比在辛烷中更可溶的有机聚合物，例如
酸。因此，通过共价附接聚赖氨酸而修饰的抗体为本发明所涵
饰本发明的抗体的亲水性聚合物可以是直链的或者分枝
烷二醇(例如PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、
右旋糖酐、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水氨基
聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷氧化物
及聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明
子实体具有约800至约150,000道
如本
术语
聚赖氨
盖。适用于修
的，并且包括例如聚
PPG等)、碳水化合物(例如
酸的聚合物(例如聚赖氨酸、
(例如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯等)
抗体的亲水性聚合物作为单独的分
尔顿的分子量。例如可以使用PEG5000和
PEG20,000，其中下标为聚合物的平均分子量的道尔顿数。亲水
可以被一个至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团所取
酸酯基团取代的亲水性聚合物可以利用合适的方
胺基的聚合物偶连于脂肪酸或脂肪酸酯的
活化的羧酸(例如用N,N-羰基二咪
性聚合物基团
代。被脂肪酸或脂肪
法来制备。例如，可将包含
羧酸，且可将脂肪酸或脂肪酸酯上
唑活化的)偶连于聚合物上的羟基。
适于修饰本发明抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或者可以含有
一个或多个不饱和单位。适于修饰本发明抗体的脂肪酸包括例如正十二烷酸
盐或酯、正十四烷酸盐或酯、正十八烷酸盐或酯、正二十烷酸盐或酯、
十二烷酸盐或酯、正三十烷酸盐或酯、正四十烷酸盐或酯、顺-δ.9-十
盐或酯、所有顺-δ.5,8,11,14-二十碳四烯酸盐或酯、辛二酸、
八烷二酸、二十二烷酸、等等。合适的脂肪酸酯包括含
烷基的二羧酸的单酯。所述低级烷基可包含1个
6个碳原子。
正二
八烷酸
十四烷二酸、十
有直链或分枝的低级
至约12个，优选1个至约
修饰的人抗体及抗原结合片段可以使用合适的方法来制备，诸如通过与
一种或多种修饰剂反应。术语“修饰剂”如本文所用的，是指包含活化基团的
合适的有机基团(例如亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是这
样的化学部分或功能基团，其在合适的条件下可以与第二化学基团反应从而
在该修饰剂与该第二化学基团之间形成的共价键。例如，胺反应性活
包括亲电性基团诸如甲苯磺酸盐或酯、甲磺酸(mesylate)、卤
碘)、N-羟基琥珀酸亚胺酯(NHS)等等。能够与硫醇反
如，马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶基
5-巯基-2-硝基苯甲酸巯基(TNB-thiol)，等
酰肼的分子，且叠氮基团可与三价
(phosphorimide)连接。用于
化基团
素(氯、溴、氟、
应的活化基团包括，例
二硫化物(pyridyl disulfides)、
等。醛功能基团可以偶连于含胺或
磷基团反应而形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺
将活化基团导入分子的合适方法是本领域已知的
G.T.、Bioconjugate Techniques、Academic Press:San
活化基团可以直接键连于所述有机基团(例如亲水性
(参见例如Hernanson、
Diego、Calif.(1996))。
聚合物、脂肪酸、脂
肪酸酯)，或者通过接头部分，例如二价C1-C12基团，
其中一个或多个碳原子可以被杂原子如氧、氮或硫替换。合适的接头部分包
括例如四乙二醇、--(CH2)3--、--NH--，仅举
以例如通过使单-Boc-烷基二胺(例如单-
脂肪酸在1-乙基-3-(3-二甲基氨基
游离胺与脂肪酸羧酸之间形成酰胺
产物去除Boc保护基以暴露伯胺，
可以与马来酸酐反应，使所
亚胺衍生物(参见例
全部教导)。
数例。包含接头部分的修饰剂可
Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与
丙基)碳二亚酰胺(EDC)的存在下反应而在
键来产生。可以用三氟乙酸(TFA)处理从
后者可以偶连于如所述的另一羧酸；或者
得产物环化而产生所述脂肪酸的经活化的马来酰
如Thompson、et al.、WO92/16221，兹通过提述并入其
本发明的修饰抗体可以通过使人抗体或抗原结合片段与修饰剂反应来
产生。例如，可以利用胺反应性修饰剂，例如PEG的NHS酯，将有机部分
以非位点特异性的方式与抗体键合。还可以通过还原抗体或抗原结合片段的
二硫键(例如链内二硫键)来制备修饰的人抗体或抗原结合片段。然后
该还原的抗体或抗原结合片段与巯基反应性修饰剂反应来产生
饰抗体。包含与本发明的抗体的特定位点键合的有机部分的修
原结合部分可以使用合适的方法来加以制备，所述方法
可以将
本发明的修
饰人抗体和抗
例如逆蛋白水解
(reverse proteolysis)(Fisch et al.、Bioconjugate Chem.、3:147-153(1992);
Werlen et al.、Bioconjugate Chem.、5:411-417(1994);Kumaran et al.、
6(10):2233-2241(1997);Itoh et al.、.、24(1):59-
Capellas et al.、.、56(4):456-463(1997))、以
G.T.、Bioconjugate Techniques、
描述的方法。
Protein Sci.
68(1996);
及Hermanson、
Academic Press:San Diego、Calif.(1996)中
本发明的抗体能够以如下所示的宽范围的亲和力(KD)结合人GD2。
抗体对抗原的亲和力或亲合力可以使用任何合适的方法通过实验确定
在本发明的方法和组合物中有用的抗GD2抗体以结合GD2为特征，并
且优选以具有低毒性为特征。具体地，本发明的抗体、特定片段或变体，其
中各别组分，诸如可变区、恒定区和框架，单独地和/或集合地，任
优选地具有低免疫原性，在本发明中是有用的。能够用于本发
地以它们能够长期治疗患者并产生可测量的症状缓解且
为特征。低或可接受的免疫原性和/或高亲和力，以及
以对达到的治疗结果起贡献。“低免疫原性”在本
或优选少于约50%的受治疗的患者中产
应答，和/或在受治疗的患者中产
(1994)、兹通过提述并入其
(参见例如Berzofsky、et al.、"Antibody-Antigen Interactions,"收录于
Fundamental Immunology、Paul、W.E.、Ed.、Raven Press:New York、N.Y.
(1984);Kuby、Janis Immunology、n and Company:New York、
N.Y.(1992);及本文中描述的方法)。具体的抗体-抗原相互作用的测得的亲
和力如果在不同的条件下(例如，盐浓度、pH)测量可能变化。因此亲和力以
及其他抗原结合参数的测量优选使用标准化的抗体及抗原溶液、以及标准化
的缓冲液(如本文中所述的缓冲液)来进行。
选地和
明的抗体任选
毒性低和/或可接受
其他适合的性质，可
文中定义为在少于约75%、
生显著的HAMA、HACA或HAMA
生低效价(Elliott et al.、Lancet344:1125-1127
全部内容)。
也可以使用双特异性、异特异性(heterospecific)、异源缀合
有
(heteroconjugate)、或类似的抗体，所述抗体是具有对至少两种不同抗原具
结合特异性的单克隆、人源化抗体。在本案中，所述结合特异性之一
针对的 是至少一种GD2蛋白质，另一种则是针对任何其他抗原。制
体的方法是本领域中已知的。传统上，双特异性抗体的
免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重
and Cuello、
这些四
只有一
造双特异性抗
重组产生是基于两个
链具有不同的特异性(Milstein
Nature305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机搭配，
体杂交瘤(quadromas)产生潜在的10种不同抗体分子的化合物，其中
种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和纯化步骤
来实现，这是相当繁重的，且产物产率较低。类似的程序在例如WO
93/08829、美国专利第6,210,668、6,193,967、6,132,992、6,106,833、
6,037,453、6,010,902、5,989,530、5,959,084、5,959,083、
5,821,333、5,807,706、5,643,759、5,601,819、
WO91/00360、WO92/00373、
(1991)、Suresh et al.、
2010、Nature Rev.10、
中有公开;本文通过
6,060,285、
5,932,448、5,833,985、
5,582,996、5,496,549、4,676,980、
EP03089号、Traunecker et al.、EMBO J.10:3655
Methods in Enzymology121:210(1986);Chan and Carter、
301-316;Weiner et al.、2010、Nature Rev.10、317-327
提述并入每一篇的全部内容。
在某些实施方案中，结合GD2的抗体可以以未缀合的形式使用。在其
在下文进一步描述的本发明的某些方法，例如检测细胞或组织中的GD2
表达作为肿瘤细胞的转移潜力的量度，或者作为鉴定组织中的原位癌(例如
DCIS或LCIS)的方法中，将抗GD2抗体缀合于一种或多种可检测标记物。
对于此类应用，抗体可以通过共价或非共价附接生色性、酶、放射性同位素、
同位素、荧光性、毒性、化学发光性、核磁共振造影剂或其他标记物。
他实施方案中，结合GD2的抗体可以缀合，例如缀合于可检测的标记物、
药物、前药或同位素。
合适的生色性标记物的例子包括二氨基联苯胺和4-羟基偶氮-苯-2-羧
合适的酶标记物的例子包括脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-类固醇异构
碱
酸。
酶、酵母-醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、过氧化物酶、
性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、
过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶、以及乙酰
脲酶、
胆碱酯酶。
合适的放射性同位素标记物的例子包括3H、111In、
125I、131I、32P、35S、
14C、51Cr、57To、58Co、
59Fe、75Se、152Eu、90Y、
67Cu、217Ci、211At、212Pb、
47Sc、109Pd、等等。111In在使用体
免了125I或内成像的场合是优选的同位素，因为其避
131I标记的GD2结合抗体被肝脏脱卤素化的问题。此外，这种放
射性核苷酸具有对于成像而言更有利的γ发射能(Perkins et al、.
Med.70:296-301(1985);Carasquillo et ah、.25:281-287(1987))。
例如，与带有1-(P-异硫氰基苄基)-DPTA的单克
肿瘤组织，尤其是肝脏中显示几乎
(Esteban et al.、.28:861-
隆抗体偶连的111In已经在非
无摄取，由此提高肿瘤定位的特异性
870(1987))。
合适的非放射性同位素标记物的例子包括157Gd、55Mn、
162Dy、52Tr、
合适的荧光标记物的例子包括152Eu标记物、荧光素标记物、异硫氰
和56Fe。
酸 盐或酯标记物、罗丹明标记物、藻红蛋白标记物、藻蓝蛋白标记物、
蛋白标记物、绿色荧光蛋白(GFP)标记物、邻苯二醛标记物、
物。
别藻蓝
和荧光胺标记
合适的毒素标记物的例子包括白喉毒素、蓖麻毒蛋白、以及霍乱毒素。
化学发光标记物的例子包括鲁米诺标记物、芳香吖啶酯标记物、吲哚标
核磁共振造影剂的例子包括重金属核如Gd、Mn、和铁。
用于将上述标记物结合于抗GD2抗体的典型技术在下述文献中提供：
为了用于本发明的某些治疗手段，诸如手术后残余肿瘤细胞的消融或者
记物、吖啶盐标记物、草酸酯标记物、荧光素标记物、荧光素酶标记物、以
及水母光蛋白(aequorin)标记物。
Kennedy等人，70:1-31(1976)，和Schurs等人，.
Acta81:1-40(1977)。后者中提到的偶联技术是戊二醛法，高碘酸盐法，二马
来酰亚胺法，m-马来酰亚胺苄基-N-羟基-琥珀酰亚胺酯法，通过提述并入其
所有这些方法。
转移的预防，可以将抗GD2抗体偶联于一种或多种药物、前药或同位素。
优选的此类缀合物包含一种或多种结合GD2的配体，例如一种或多种抗体
或片段、其衍生物或变体，所述配体缀合于一种或多种细胞毒剂；这样的缀
合物可用于本发明提供的治疗和预防肿瘤转移的方法。根据本发明的
类实施方案，抗GD2抗体与细胞毒剂缀合。可用于生成抗
剂缀合物的细胞毒剂，例如化疗剂是本领域公知的，包
铂、奥沙利铂、紫杉醇、美法仑、多柔比星、甲
泊苷、氮芥、环磷酰胺、博来霉素、微管毒物、
(annonaceous acetogenins)。其他适于依照本发明
某些此
GD2抗体-细胞毒
括但不限于顺铂、卡
氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、依托
以及番荔枝己酸配质
的该方面使用的化疗剂是公
知的，普通技术人员将熟悉之。
本文还想到了一种或多种抗GD2抗体与一种或多种小分子毒素的缀合
物的用途，所述小分子毒素诸如加利车霉素
(calicheamicin)、美登木素
以及CC1065。在本发明的一
(maytansine)(美国专利5,208,020)、trichothene、
个实施方案中，抗GD2抗体缀合于一种
GD2抗体约1个至约10个美登木素分子)。或多种美登木素分子(例如每个抗
美登木素可以例如转化为
并与经修饰的抗GD2抗体反
May-SS-Me，May-SS-Me可以还原为May-SH3
应来产生美登木素生物碱-抗GD2抗体缀
127-131(1992))。 合物(Chari et Research52:
或者，可以将抗GD2抗体与一个或多个加利车霉素分子缀合。加利车
可用来与一个或多个抗GD2抗体生成缀合物的酶活毒素及其片段包括
毒
白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢
菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲
根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香
石竹(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白（PAPI、PAPII和
PAP-S）、苦瓜(momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆
蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、
霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依
(enomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年
文公布的WO93/21232，兹通过提述并入其全部公开内
素生物碱缀合于一个或多个抗GD2抗体。
霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车
霉素的结构类似物(Hinman et Research53:3336-3342(1993)and
Lode et Research58:2925-2928(1998))。
丝林
诺霉素
10月28日以英
容。也可以将美登木
本发明还设想了与具有核酸水解活性的化合物（如核糖核酸酶或DNA
有多种放射性同位素可用于生成放射偶联HER2抗体。例子包括
At211、 I131、I125、Y90、
内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶）缀合的抗GD2抗体。
Re186、Re188、Sm153、Bi212、
P32和Lu的放射性同位素。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗GD2抗体和细胞毒剂的缀合
胺
物，诸如3-(2-吡啶基二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚
甲基）环己胺-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸
己二酰亚胺二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚胺
戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对叠氮苯甲酰基)己
（诸如双(对重氮苯
酯）、和双活
例如，可如
疫毒素。碳-
(MX-DTPA)
见
如盐酸
酯）、醛类（诸如
二胺）、双重氮衍生物
甲酰基)己二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸
性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。
Vitetta et al.、Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免
14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸
是用于将放射性核苷酸与抗GD2抗体缀合的例示性螯合剂。参
WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接
或者，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗GD2抗体配体和细
本发明还提供至少一种抗GD2抗体组合物，其包含至少一种、至少两
胞毒剂的融合蛋白。
头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化
物接头（Chari et al.、Cancer Research52:127-131(1992)）。
种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多种如本文中所描述的
和/或如现有技术已知的抗GD2抗体，以非天然存在的组合物、混合
式提供。这样的组合物包括：非天然存在的组合物，其包含选
GD2抗体氨基酸序列的至少一种或两种全长、C-和/或N-段缺
片段或特定的变体：如本文所述的抗体的CDR区的
或其特定的片段、域或变体。优选的抗GD2抗
抗GD2抗体氨基酸序列的至少一种含
种全长的序列、片段、域或变体。
GD2抗体的CDR区域的
是液体或干溶液、混
克分子浓度
本文中
物或形
自下组的抗
失的变体、域、
70-100%的连续氨基酸，
体组合物包括如本文所述的
CDR或LBR的部分的至少一种或两
进一步优选的组合物包含如本文所述的抗
70-100%的至少一种的40-99%。这样的组分百分比
合物、悬浮液、乳液或胶体的重量、体积、浓度、体积
(molarity)或重量克分子浓度(molality)百分比，如本领域公知或如
所述的。
本发明的抗GD2抗体组合物可以进一步包含任意适当的有效量的组合
物或药物组合物中的至少一种，所述组合物包含需要这种调节、处理或治疗
的细胞、组织、器官、动物或患者的至少一种抗GD2抗体，该组合
进一步包含选自下列的至少一种：至少一种TNF拮抗剂(例如
抗体或片段、可溶性TNF受体或其片段、其融合蛋白、
剂)、抗风湿药物(如氨甲喋呤、金诺芬、金硫葡萄糖、
硫代苹果酸金钠、硫酸羟基氯喹、来氟米特、柳
麻醉药(narcotic)、非甾体类抗炎药(NSAID)、止
部麻醉药、神
生虫剂、抗病
内酯、青霉素、
醇、促蛋白合
生素、
物任选
但不限于TNF
或小分子TNF拮抗
硫唑嘌呤、依那西普、
氮磺吡啶)、肌肉驰缓剂、
痛剂、麻醉剂、镇静剂、局
经肌肉阻滞剂、抗微生物剂(例如氨基糖苷、抗真菌剂、抗寄
毒剂、碳青霉素烯(carbapenem)、头孢菌素、氟喹诺酮、大环
磺胺、四环素、其他抗微生物剂)、抗银屑病药、皮质类固
成类固醇、糖尿病相关药剂、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维
钙相关激素、抗腹泻药、止咳药、抗呕吐药、抗溃疡药、通便药、抗
凝剂、促红细胞生成素(例如红细胞生成素(Epoetin)α)、菲格司亭
(filgrastim)(如G-CSF、优保津)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫法、免
疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环孢霉素、达克珠单抗)、生长激
素、激素替代药物、雌激素受体调节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷化剂、
抗代谢药、有丝分裂抑制剂、放射性药剂、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗
药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、
药物、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄
上腺素或类似物、α链道酶(Pulmozyme)、细胞
细胞疗法(cell therapies)。此类细胞因子的
至IL-34中的任何一种。合适的剂量是本
编，Pharmacotherapy Handbook、
Conn.(2000)；
精神病
他克林、哮喘
嘌呤、色甘酸钠、肾
因子或细胞因子拮抗剂、以及
非限制性实例包括但不限于IL-1
领域公知的，参见例如Wells等人
2nd Edition、Appleton and Lange、Stamford、
PDR Pharmacopoeia、Tarascon Pocket Pharmacopoeia2000、
这些抗癌症或抗感染剂也可以包括与本发明的至少一种抗体缔合、结
合、共同配制或共同施用的毒素分子。毒素可以任选选择性地杀灭病变细胞
或组织。病变细胞可以是癌症或其他细胞。此类毒素可以是，但不限
化的或重组的毒素或毒素片段，它包含如选自蓖麻毒蛋白、白
毒素或细菌毒素中的至少一种的毒素的至少一种功能性
素也包括由任意天然存在的、突变或重组细菌或
们可以导致人类或其他哺乳动物中的任意
克。此类毒素可以包括，但不限于，产肠
(LT)、热稳定性肠毒素(ST)、志贺
休克综合征毒素-1(TSST-1)、
链球菌肠毒素等。所述细菌
肠出血性大肠杆菌
Deluxe Edition、Tarascon Publishing、Loma Linda、Calif.(2000)，兹通过提
述并入这些参考文献每一篇的全部内容。
于，纯
喉毒素、蛇毒
细胞毒性域。术语毒
病毒的内毒素和外毒素，它
病理学状况，包括致死的毒素休
毒素的大肠杆菌的热不稳定肠毒素
氏菌细胞毒素、气单胞菌肠毒素、中毒性
葡萄球菌肠毒素A(SEA)、B(SEB)或C(SEC)、
包括，但不限于，产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)、
(如血清型0157:H7的菌株)、葡萄球菌属物种(如金黄色葡
萄球菌、化脓性葡萄球菌)、志贺氏菌属菌种(如痢疾志贺氏菌、弗氏
菌(Shigella flexneri)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)和索氏志
sonnei))、沙门氏菌属菌种(如伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙
菌)、梭菌属菌种(如产气荚膜梭菌、艰难梭菌、
(如空肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌)、螺杆
胞菌属菌种(例如温和气单胞菌、嗜水气
单胞菌(Pleisomonas shigelloides)、
志贺氏
贺氏菌(Shigella
门氏菌、肠炎沙门氏
肉毒梭菌)、弯曲杆菌属菌种
菌属菌种(例如幽门螺杆菌)、气单
单胞菌、豚鼠气单胞菌)、类志贺邻
小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersina enterocolitica)、弧菌属菌种(例如霍乱弧
种、铜绿假单胞菌和链球菌。参见
3rd ed.，pp1-13，Little，
菌、副溶血弧菌)、克雷伯氏菌属菌
例如Stein编，INTERNAL MEDICINE，
Brown and Co.，Boston,(1990);Evans等人编，Bacterial
Infections of Humans:Epidemiology and Control，.，pp239-254，Plenum
Medical Book Co,New York(1991);Mandell等人，Principles and Practice of
Infectious Diseases，.,Churchill Livingstone，N.Y.(1990);Berkow等人
编，The Merck Manual，16th edition，Merck and Co.，Rahway，N.J.，
等人，FEMS Microbiology Immunology，76:121-
Science，248:705-711(1990)，兹通过提述并入这
1992;Wood
134(1991);Marrack等人，
些参考文献的全部内容。
本发明的抗GD2抗体化合物，组合物或其组合可以进一步包含任意适
当辅助物质，例如但不限于稀释剂，粘合剂，稳定剂，缓冲剂，盐，亲脂溶
剂，防腐剂，佐剂等中的至少一种。优选可药用的辅助物质。此类无
的非限制性的例子和制备方法是本领域公知的，例如，但不限
Ed.，Remington's Pharmaceutical Sciences， Edition，
Co.(Easton，Pa.)1990。可药用的担载体可以常规选择，
GD2抗体，片段或变体组合物的施用方式，溶解度和/
公知或如本文所描述的。
菌溶液
于Gennaro，
Mack Publishing
此类担载体适于抗
或稳定性，如本领域
可用于本发明组合物的药物赋形剂和添加剂包括，但不限于蛋白质、肽、
赋
氨基酸、脂质和碳水化合物(如糖，包括单糖、双糖、三糖、四糖和寡糖；
衍生化糖，如醛醇、醛酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，它们可以单
个或组合存在，单独地或组合地占重量或体积的1-99.99%。示例性的蛋白
形剂包括血清白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、
酪蛋白等。可以起缓冲作用的代表性氨基酸/抗体成分包括丙
精氨酸、甜菜碱、组氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、半胱氨
异亮氨酸、缬氨酸、
是甘氨酸。
明胶、
氨酸、甘氨酸、
酸、赖氨酸、亮氨酸、
甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺等。一种优选的氨基酸
适合用于本发明的碳水化合物赋形剂包括，例如单糖，如果糖、麦芽糖、
纤
半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；双糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、
维二糖等；多糖，如棉籽糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉
及醛醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨
醇)、肌醇等。用于本发明的优选的碳水化合物赋形剂是甘露
棉籽糖。
等；以
糖醇(葡萄糖
醇、海藻糖和
抗GD2抗体组合物也可以包含缓冲剂或pH调节剂；一般地，缓冲剂
是由有机酸或碱制备的盐。代表性的缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗
坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；
盐酸三羟甲基氨基甲烷(tromethamine)、或磷酸缓冲液。用于本发明
中的优选缓冲剂是有机酸盐如柠檬酸盐。
Tris，
的组合物
此外，本发明的抗GD2抗体组合物可包括聚合物赋形剂/添加剂，如聚
乙烯吡咯烷酮、菲柯尔(ficolls)(一种聚合的糖)、葡聚糖结合剂(dextrates)(例
如环糊精、诸如2-羟基丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、矫味剂、抗微生物剂、
如
增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(如聚山梨醇酯、例如"吐温20"
和"吐温80")、脂质(如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)，和螯合剂(例
EDTA)。
适用于抗GD2抗体、部分或变体组合物的这些和其他赋形剂和/或添加
剂是本领域公知的，例如，列于"Remington:The Science&Practice of
Pharmacy"、 ed.、Williams&Williams、(1995)、
Desk Reference"、 ed.、Medical Economics、
在此通过述及引入其完整公开内容。优选的载体
(如糖和醛醇)和缓冲剂(如柠檬酸盐)或聚
and in the"Physician's
Montvale、N.J.(1998)，
或赋形剂物质是碳水化合物
合剂。
如前文指出的，本发明提供了稳定的制剂，优选为含有盐水或选定的盐
的磷酸盐缓冲液，以及含有防腐剂的储存溶液和制剂，适于药用或兽医用途
的多用途贮存制剂，包含置于可药用制剂中的至少一种抗GD2抗体。
制剂包含在水性稀释剂中的至少一种已知的防腐剂或任选选自至少一
酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧
甲醛、三氯叔丁醇、氯化镁(例如六水合物)、对羟基苯甲酸烷
酯、丙酯、丁酯等)、苯扎
混合物。可以使用本
其中的任意范
0.02、
储存
种苯
乙醇、
基酯(甲酯、乙
氯铵、苄索氯铵、甲醋吡喃酮钠和硫柳汞、或其
领域公知的任何适当浓度或混合物，例如0.001-5%，或
围或任意值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、
0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、
1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、
2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、
4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、或其中的任意范围或任意值。
包括，无防腐剂，0.1-2%间甲酚(例如0.2、0.3.0.4、0.5、
苯甲醇(例如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%)、
3.9、4.0、
非限制性实例
0.9、1.0%)、0.1-3%
0.001-0.5%硫柳汞(例如
0.28、0.5、0.9、1.0%)、
0.005、0.01)、0.001-2.0%苯酚(例如0.05、0.25、
0.0005-1.0%对羟基苯甲酸烷基酯(例如0.00075、
0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、
0.9、1.0%)，等等。
0.0009、0.001、0.002、0.005、
0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、
如前文指出的，本发明提供一种制品，其包括包装材料和至少一个管形
瓶，其中包含至少一种抗GD2抗体的溶液和规定的缓冲剂和/或防腐剂，任
选溶于水性稀释剂中，其中所述包装材料包含标签，该标签标明所述溶剂可
以保留1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、
66、72个小时或更长的时间。本发明进一步包括一种制品，
料和含有至少一种冻干的抗GD2抗体的第一管形瓶，
或防腐剂的水性稀释剂的第二管形瓶，其中所述
指导患者在水性稀释剂中复原所述至少一
留24小时或更长时间的溶液。
54、60、
其包括包装材
和含有规定的缓冲剂
包装材料包含标签，该标签
种抗GD2抗体，以便形成可以保
根据本发明使用的至少一种抗GD2抗体可以通过重组方法产生，包括
本发明的产品中的至少一种抗GD2抗体的范围包括在湿/干体系中重构
时产生约1.0μg/ml至约1000mg/ml的量，但更低和更高的浓度也是可行的，
并且依赖于准备使用的递送载体，例如溶液制剂将不同于经皮贴剂、
粘膜或渗透或微泵方法。
从哺乳动物细胞或转基因制备物产生，或者从其他生物来源纯化，如本文中
所述或本领域公知的。
肺、经
优选地，所述水性稀释剂任选进一步包含可药用的防腐剂，优选的防腐
剂包括选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲
酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、
钠和硫柳汞、或其混合物的那些。苯扎氯铵、苄索氯铵、甲醋吡喃酮
用于制剂中的防腐剂的浓度为足以产生抗 微生物作用的浓度。这些浓
容易确定。 度取决于选择的防腐剂，并且本领域技术人员很
任选地和优选地，可以将其他赋形剂，如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、
防腐增强剂加入稀释剂中。等渗剂如甘油等通常以公知的浓度使用。优选加
入生理耐受的缓冲剂以改进pH控制。制剂可以有宽范围的pH值，
pH4-约pH10，优选约pH5-约pH9，最优选约pH6.0-约pH8.0。
剂的pH优选为约6.8-约7.8。优选的缓冲液包括磷酸盐缓冲
酸盐，特别是磷酸缓冲盐水(PBS)。
例如约
本发明的制
液，最优选为磷
也可以任选向制剂或组合物中加入其他添加剂，如可药用的增溶剂，如
料
吐温20(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯)、吐温40(聚氧乙烯(20)失水
山梨醇单棕榈酸酯)、吐温80(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯)、Pluronic
F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)、和PEG(聚乙二醇)或非离子型表面活
性剂，如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆84或88、多元醇，其他
嵌段共聚物，以及螯合剂如EDTA和EGTA，以减少聚集。如果用泵或塑
容器来施用制剂，这些添加剂是特别有用的。可药用的表面活性剂的
减少蛋白质聚集的倾向。 存在可
本发明的制剂可以通过以下方法制备：包括将至少一种抗GD2抗体与
选自苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基
酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、甲醋吡喃酮
柳汞或其混合物在水性稀释剂中混合。采用常规的溶解和混合
释剂中混合所述至少一种抗GD2抗体和防腐剂。为了
如，可以将测得量的溶于缓冲液中的至少一种抗
需要浓度的蛋白质和防腐剂的缓冲液中混合。本
法的变化，例如，加入各成分的顺序、是
温度和pH都是可以对使用的浓度
钠和硫
物种在水性稀
制备适当的制剂，例
GD2抗体在其量足以提供
领域技术人员可以了解该方
否使用其他添加剂、制备该制剂的
和施用方式进行优化的因素。
可以将要求保护的制剂以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给患
者，双管形瓶包含一个装有至少一种冻干的抗GD2抗体的管形瓶，所述抗
体用含有水、防腐剂和/或赋形剂、优选磷酸盐缓冲剂和/或盐水和溶于水性
稀释剂中的选定的盐的第二个管形瓶复原。单一溶液的管形瓶或要求复原的
双管形瓶可以重复使用多次，并且可以满
此比现有的方法提供更方便的治疗足患者治疗的单个或多个周期，因
方案。
本发明的制品可用于立即至24小时或更长的时间内施用。因此，本申
请要求保护的制品为患者提供了显著的好处。本发明的制剂任选可以安全地
储存在约2℃至约40℃的温度下，并且长时间保持蛋白的生物活性，
许包装标签指明该溶液可以在超过6、12、18、24、36、48、
时的时间内保存和/或使用。如果使用了储存稀释剂，该标签
个月、半年、一年半和/或两年的使用。
因此容
72、或96小
可包括长达1-12
本发明中的至少一种抗GD2抗体溶液可以通过包括在水性稀释剂中混
合至少一种抗体的方法来制备。采用常规的溶解和混合步骤进行混合。为了
制备适当的稀释剂，例如，可以将测得的量的溶于水或缓冲液中的至
抗体以足以提供所需浓度的蛋白的量与任选的防腐剂或缓冲液
技术人员可以了解该方法的变化。例如，加入各成分的
添加剂、制备该制剂的温度和pH都是可以对使
化的因素。
少一种
混合。本领域
顺序、是否使用其他
用的浓度和施用方式进行优
要求保护的产品可以以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给患者，
双管形瓶包含一个装有至少一种冻干的抗GD2抗体的管形瓶，所述抗体用
含有水性稀释剂的第二个管形瓶复原。单一溶液的管形瓶或要求复原的管形
瓶可以重复使用多次，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，因
有的方法提供更方便的治疗方案。 此比现
要求保护的产品可以以澄清的溶液或作为双管形瓶的形式提供给药店、
诊所或其他机构和设施，从而间接提供给患者，其中双管形瓶包含一个装有
至少一种冻干的抗GD2抗体的管形瓶，所述抗体用含有水性稀释剂
个管形瓶复原。此情况下的澄清溶液最多达1升或甚至更多，
存容器，其中可以一次或多次取出至少一种抗体溶液的
至更小的管形瓶中，由药店或诊所提供给用户和
的第二
提供于大的储
更小部分，将其转移
/或患者。
公认的包括这些管形瓶体系的设备包括用于递送溶液的笔式注射器，例
如BD笔，例如由Becton Dickensen(Franklin Lakes，N.J.,)，
Disetronic(Burgdorf，Switzerland,;Bioject，Portland，Oreg.;
National Medical Products，Weston Medical(Peterborough，UK)，Medi-
(Minneapolis、Minn.)等生产和开发的。公认的包括双管形瓶
在药筒中递送复原的冻干药
Ject Corp
的设备包括用于
物的笔式注射器系统，
当前要求保护的产品包括包装材料。除了管理部门要求的信息，包括材
料还提供可以使用该产品的条件。本发明的包装材料为患者提供以下说明：
用双管形瓶的湿/干产品在水性稀释剂中复原至少一种抗GD2抗体，
溶液，并且在2-24小时或更长的时间内使用该溶液。对于单
产品，标签说明该溶液可以在2-24小时或更长的时间
护的产品可以用于人类药用产品用途。
以形成
管形瓶的溶液
内使用。当前要求保
本发明的制剂可以通过以下方法制备，所述方法包括混合至少一种抗
GD2抗体和选定的缓冲剂，优选含有盐水或选定的盐的磷酸盐缓冲剂。用
常 规溶解和混合步骤在水性缓冲液中缓和至少一种抗体和缓冲剂。为了
当的制剂，例如，可以将测得量的溶于水或缓冲液中的至少一
提供所需浓度的蛋白和缓冲剂的量与所需缓冲剂在水中
员可以了解该方法的变化。例如，对于所使用的
的顺序、是否使用其他添加剂、制备该制
的因素。
制备适
种抗体以足以
混合。本领域技术人
浓度和施用方式加入各成分
剂的温度和pH都是可以加以优化
要求保护的稳定或储存的试剂可以以澄清的溶液或者作为双管形瓶的
形式提供给患者，双管形瓶包含一个装有至少一种冻干的抗GD2抗体的管
形瓶，所述抗体用含有水性稀释液的第二个管形瓶复原。单一溶液的管形瓶
或要求复原的双管形瓶可以重复使用多次，并且可以满足患者治疗的
多个周期，因此比现有的方法提供更方便的治疗方案。 单个或
可以更加本发明通过各种递送方法给予患者此处描述的至少一种抗
抗体的稳定或储存制剂或溶液；所述方法包括皮下或肌肉内注射；经皮、
在本发明的一个实施方案中，包含本公开的抗GD2抗体的药物组合物
GD2
肺部、经粘膜、植入、渗透泵、药筒、微泵，或其他本领域技术人员了解的
手段，如本领域公知的。
使人源化抗体对生物体，优选动物，优选哺乳动物的施用变得容易。具体的
哺乳动物包括牛、犬、马、猫、绵羊和猪类动物，非人灵长类，以及
是特别优选的。 人。人
针对GD2的高亲和力、中和性嵌合或人抗体在表达GD2的疾病中的使
用可能是理想的，例如，GD2在>50%的黑素瘤(Zhang et al.，1997，Int.J.
Cancer.73，42-49)、88%的骨肉瘤(Heiner et al.，1987，Cancer Res.47，
5377-5388)、以及93%的软组织肉瘤包括脂肪肉
瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组 织细胞瘤、平滑肌肉瘤、以及梭形细胞肉
633-638)，还有脑肿瘤(Longee et al.，
表达。抗GD2抗体已经通过静脉
(compartmental therapy)在具有下述
et al，1992，
瘤(Chang et al.、1992、Cancer70、
1991，Acta Neuropathol.82，45-54)中
内注射以及使用奥马耶贮器的隔室疗法
疾病的患者中进行了测试：黑素瘤(Saleh
dies Hybridomas3，19-24;Cheung et al.，1987，.
Oncol.5，1430-1440;Choi et al.，2006，Cancer ther.55，
761-774)、肉瘤(Choi et al.，2006，同上;Yeh et al.，1992，The fifth Asia and
Oceania Congress of Nuclear Medicine and Biology Proceedings，p.104)、小细
胞肺癌(Grant et al.、1996、.23、145-149)、脑肿瘤(Arbit et al.，
1995，.22，419-426)、通过静脉注射以及通过使用
储库(Kramer et al.，2007，.25，5465-5470)。GD2
母细胞瘤(Chantada et al.，2006，.28，
HTLV-1感染的T细胞白血病细胞(Furukawa et al.，1993，
1972-1976)的肿瘤靶。在一个优选的方面，本公开的抗
疗神经母细胞瘤。抗GD2抗体或其衍生物可以
剂组合。此外，这些单抗可以用作化学敏
可以改善放射的效力。它们还可以
和/或IFNα组合使用。此外，抗
TNF-α、IL-12/IL-23、IL-2、
受体等组合使用，以
Mylotarg、Campath、
用。
Ommaya
也是视网膜
369-373)以及
PNAS USA90，
GD2抗体可以用来治
用作单一药剂或与其他治疗
化剂(chemosensitizer)，它们的使用
与其他肿瘤免疫调节剂诸如IL-2、IL-12
GD2抗体可以与其他单克隆抗体诸如抗
GpIIb/IIIa受体、CD52、CD20、RSV蛋白、HER2/neu
及与经批准上市的抗体包括Rituxan、Herceptin、
Zevalin、Bexxar、Erbitux、Avastin和Vectibix组合使
因此，本发明还提供一种使用本发明的抗GD-2抗体调节或治疗如本领
域已知或本文中记载的、细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种
相关疾病的方法。 GD2
本发明包括一种用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至
少一种恶性疾病的方法，所述疾病包括但不限于下列中的至少一种：多发性
骨髓瘤、白血病、急性白血病、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、B细
细胞或FAB ALL、急性髓性白血病(AML)、慢性髓细胞白血病
淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征
瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非
性骨髓瘤、卡波西肉瘤、结
癌、恶性组织细胞病、
恶性黑素瘤、血管瘤、
痛；癌症转移的阻遏；
小球肾炎等的治疗。
新生剂、化疗剂、法
治疗、抗血管新生剂、
施用。
胞、T
(CML)、慢性
(MDS)、淋巴
何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发
肠直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、鼻咽
副肿瘤综合征/恶性高钙血症、实体瘤、腺癌、肉瘤、
转移性疾病、癌症相关的骨重吸收、癌症相关的骨疼
癌症恶病质的改善；以及炎症性疾病如系膜增生性肾
这样的方法可任选地与GD2抗体、放射治疗、抗血管
尼基转移酶抑制剂等联用，通过在该GD2抗体、放射
化疗剂、法尼基转移酶抑制剂施用之前、同时或之后
本发明还提供一种调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少
一种GD2介导的免疫相关疾病的方法，所述疾病包括但不限于下列中的至
少一种：类风湿性关节炎，青少年类风湿性关节炎，全身发病的幼年类风湿
性关节炎、银屑病关节炎、强制性脊柱炎、胃溃疡、血清阴性关节病、
节炎、炎性肠病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征、
状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、特发性肺纤维化、系统性血管炎/
肉样瘤病、睾丸炎/输精管切除逆转程序、过敏性/特应
性鼻炎、湿疹、变应性接触性皮炎、变应性结膜
官移植排斥、移植物抗宿主病、全身炎症
氏阳性菌脓毒症、革兰氏阴性菌脓
中性粒细胞减少性发热、尿
离子辐射暴露、急性胰腺炎、
诱导的肝炎、慢性炎症病变、
骨关
虹膜睫
韦格纳肉芽肿、
性疾病、哮喘、过敏
炎、过敏性肺炎、移植、器
反应综合征、脓毒症综合征、革兰
毒症、培养阴性菌脓毒症、真菌脓毒症、
脓毒症、脑膜炎球菌血症、创伤/出血、烧伤、
成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、酒精
肉样瘤病、克罗恩氏病(Crohn's pathology)、镰
病、特应性疾病、过敏反应、变应性鼻炎、枯草
刀状细胞贫血、糖尿病、肾
热、终年性肺炎、结
恶性贫血、血
植排斥、
植
膜炎、子宫内膜异位、哮喘、风疹、全身过敏、皮炎、
小板减少症、溶血性疾病、任何器官或组织的移植排斥、肾移
心脏移植排斥、肝移植排斥、胰腺移植排斥、肺移植排斥、骨髓移
(BMT)排斥、皮肤同种异体移植排斥、软骨移植排斥、骨移植排斥、小肠
移植排斥、胎儿胸腺移植排斥、甲状旁腺移植排斥、任何器官或组织的异种
移植排斥、同种异体移植排斥、抗受体过敏反应、格雷夫斯病、雷诺
(Raynaud’s disease)、B型胰岛素抵抗糖尿病、哮喘、重症肌无力、抗
的细胞毒性、III型过敏反应、系统性红斑狼疮、POEMS综合
病、器官巨大、内分泌病、
神经病、器官巨大、内分泌
脂综合征、天疱疮、硬皮病、
病、慢性活动性肝炎、原发
开后综合征、IV型过敏、
内生物引起的肉芽肿、
病、α-1-抗胰岛素缺
脑-垂体-肾上
质、囊
血巨噬
氏病
体介导
征(多发性神经
单克隆γ球蛋白病和皮肤改变综合征)、多发性
病、单克隆γ球蛋白病、皮肤改变综合征、抗磷
混合性结缔组织病、特发性阿狄森氏病、糖尿
性胆汁性肝硬化、白癜风、血管炎、MI心脏切
接触性皮炎、过敏性肺炎、同种异体排斥、细胞
药物过敏、代谢性/特发性威尔逊氏病、血色素沉着
陷、糖尿病肾病、桥本氏甲状腺炎、骨质疏松症、下丘
腺轴评估、原发性胆汁性肝硬化、甲状腺炎、脑脊髓炎、恶液
性纤维化、新生儿慢性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、家族性
细胞淋巴细胞组织细胞增多症、皮肤病学状况、银屑病、斑秃、肾病
综合征、肾炎、肾小球肾炎、急性肾衰竭、血液透析、尿毒症、中毒、惊厥
前状态、okt3治疗、抗cd3治疗、细胞因子治疗、化疗、放疗(如包
不限于虚弱、贫血、恶液质等)、慢性水杨酸盐中毒、睡眠性
胖、心脏衰竭、窦炎、炎性肠病等。见，例如
12th-17thEditions，Merck&Company，Rahway，
1992，1999)，Pharmacotherapy Handbook，
Appleton and Lange，Stamford，
括，但
呼吸暂停、肥
the Merck Manual，
NJ(1972，1977，1982，1987，
Wells et al.，eds.，SecondEdition，
Conn.(1998，2000)，每一篇通过在此引入作
为参考。
本发明也提供了一种调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至
少一种感染疾病的方法，所述疾病包括，但不限于，以下疾病中的至少一种：
急性和慢性细菌感染、急性和慢性寄生或感染过程，包括细菌、病毒
感染、HIV感染/HIV神经病、脑膜炎、肝炎(甲型、乙型或丙
关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌0157:h7、
血栓溶解性血小板减少性紫癜、疟疾、登革热、
休克综合征、链球菌肌炎、气性坏疽、分
支杆菌
和真菌
型等)、脓毒性
溶血性尿毒症综合征/
利什曼病、麻风病、中毒性
支杆菌结核、胞内鸟型分枝杆菌分
(mycobacterium avium intracellulare)、间质性浆细胞肺炎、盆腔炎性疾
上述任何方法可以任选包括给予需要所述调节、处理或治疗的细胞、组
本发明的任何方法可以包括，给予需要这种调节、处理或治疗的细胞、
组织、器官、动物、病人有效量的包含至少一种抗GD2抗体的组合物或药
物组合物。所述方法可以任选进一步包括用于治疗这些免疫疾病或恶性疾病
的共同施用或联合治疗，其中给予所述至少一种抗GD2抗体、其特
或变体，进一步包括在之前、同时和/或之后，给予至少一种
一种的药物：TNF拮抗剂(例如，但不限于TNF抗体或
受体或其片段、其融合蛋白、或小分子TNF拮抗剂)、
段、小分子IL-18拮抗剂或IL-18受体结合蛋白、IL-1
或片段、可溶性IL-1受体拮抗剂、抗风湿药物
葡萄糖、硫唑嘌呤、依那西普、硫代苹果
织、器官、动物或患者有效量的至少一种含有至少一种抗GD2抗体的组合
物或药物组合物。
病、睾丸酮/附睾炎、军团菌病、莱姆病、甲型流感、埃巴二氏病毒、生命
体征相关的血巨噬细胞综合征、致命性脑炎/无菌性脑膜炎等；
定部分
选自下组至少
片段、可溶性TNF
IL-18抗体或抗体片
抗体(包括IL-1α和IL-1β)
(如氨甲喋呤、金诺芬、金硫
酸金钠、硫酸羟基氯喹、来氟米特、 柳氮磺胺吡啶)、放疗、抗血管新
醉药、非甾体类抗炎药
神经肌肉阻滞剂、抗
毒剂、碳青霉素烯、
素、其它抗微
糖尿病相关试
红细胞
(GM-
生剂、化疗剂、沙利度胺肌肉松弛剂、麻
(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、
微生物剂(如氨基糖苷、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病
头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺、四环
生物剂)、抗银屑病药物、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、
剂、矿物质、营养剂、甲状腺制剂、维生素、钙相关激素、促
生成素(如epoetinα)、菲格司亭(如G-CSF，优保津)、沙格司亭
CSF，Leukine(重组GM-CSF))、免疫接种、免疫球蛋白、免疫抑制剂(如
巴利昔单抗、环孢霉素、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素
受体调节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、
放射性药物、抗抑郁剂、抗躁狂药、抗精神病药物、抗焦虑药、催眠
交感神经药物、刺激剂、多奈哌齐、他克林、抗哮喘药、β激
类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸钠、肾上
道酶(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。适当
的。见，例如，Wellset al.，eds.，
Appleton andLange，
药、拟
动剂、吸入性
腺素或类似物、α链
的剂量是本领域公知
Pharmacotherapy Handbook，2nd Edition，
Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon
适用于本发明的组合物、联合治疗、共同施用、设备和/或方法的TNF
拮抗剂(进一步包括本发明的至少一种抗体、其特定片段和变体)包括，但不
限于，抗TNF抗体、其抗原结合片段、以及与TNF特异性结合的受体分子；
防止和/或抑制TNF合成、TNF释放或
哌啶酮、替尼达普、磷酸二酯酶抑
腺苷受体激动剂和A2b腺苷受体
PocketPharmacopoeia2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，LomaLinda，
CA(2000)，兹通过提述并入这些参考文献每一篇的全部内容。。
TNF作用于靶细胞的化合物，如酞胺
制剂(如己酮可可碱和环戊苯吡酮)、A2b
增强剂；防止和/或抑制TNF受体信号传递 的化合物，如有丝分裂原激
TNF裂解的化合物，如金
物，如血管紧张素转
活性产生和/或合成
活的蛋白(MAP)激酶抑制剂；阻断和/或抑制膜
属蛋白酶抑制剂；阻断和/或抑制TNF活性的化合
化酶(ACE)抑制剂(如卡托普利)；和阻断和/或抑制TNF
的化合物，如MAP激酶抑制剂。
本发明的任何方法可以包括治疗GD2介导的病症或以GD2表达为特征
的病症的方法，所述方法包括给予需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、
器官、动物或患者有效量的包含至少一种GD2抗体的组合物或药物
所述方法可以任选进一步包括用于治疗这些免疫疾病的共同施
疗，其中给予所述至少一种抗GD2抗体、其特定部分或变体，
在之前、同时和/或之后，给予至少一种上述试剂。
组合物。
用或联合治
进一步包括
一般地，病理学状况的治疗是通过给予有效量或剂量的至少一种抗GD2
抗体组合物而实现的，该组合物中平均总共含有至少约0.01-500mg至少一
种抗GD2抗体/千克患者体重/剂，优选每单次或多次施用约0.1-100mg抗体
/千克患者体重，这取决于组合物中含有的具体活性。或者，有效血清浓度
可以包括每单次或多次施用0.1-5000μg/ml的血清浓度。适当的剂量是医学
从业者已知的，当然，取决于特定的疾病状态、给予的组合物的具体活性、
以及患者正在进行的具体治疗。在一些情况下，为获得需要的治疗量，
能必须提供重复施用，即重复特定监测或计量剂量的各次施用，其中
次施用，直到达到需要的每日剂量或效果。
有可
重复各
优选的剂量可以任选包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、
35、36、
51、52、53、
67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、
89、90、91、92、93、94、95、96、97、
或其中的任意范围、任意值或任意分数，
0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、
83、84、85、86、87、88、
98、99和/或100-500mg/kg/施用，
或每单次或多次施用达到0.1、0.5、
2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、
5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、
10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、
14.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、
9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、
13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、
18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、
29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、
200、300、400、500、600、700、800、900、
3500、4000、4500、和/或
或任意分数。
14.0、
8.9、9.0、
13.0、13.5、
17.9、18、18.5、
24、25、26、27、28、
80、85、90、96、100、
1000、1500、2000、2500、3000、
5000μg/ml血清浓度，或其中的任意范围、任意值
此外，施用剂量可以根据已知因素而改变，例如具体试剂的药代动力学
特征，以及其施用模式和途径；接受者的年龄、健康和体重；症状的性质和
范围；同时进行的治疗的类型、频率，以及需要的效果。通常活性成
量为约0.1-100mg/kg体重。通常为0.1-50，优选0.1-10mg/kg/
效获得需要的结果的持续释放形式。
分的剂
施用，或以有
作为非限制性实例，人或动物的治疗可以通过一次或周期剂量的至少一
种本发明的抗体而提供，其剂量为0.1-100mg/kg，例如0.5、0.9、1.0、1.1、
1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、
80、90或100mg/kg/日，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、
18、
60、70、
10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或
或作为选择或额外地在第1、2、3、4、5、6、7、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
31、32、33、34、35、36、37、38、39、
48、49、50、51、或52周的至少
3、4、5、6、7、8、9、10、
年中的至少一年中施用，或
25、26、27、28、29、
40天中的至少一天施用，
8、9、10、11、12、13、
25、26、27、28、29、30、
40、41、42、43、44、45、46、47、
一周施用，或作为选择或额外地在1、2、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20
其任意组合，采用单次、输注或重复给药。
适于内部施用的剂型(组合物)一般包含约0.1mg-约500mg活性成分/单
对于肠胃外施用，可以将抗体配制为与可药用的肠胃外载体结合或分别
提供的溶液、悬浮液、乳液或冻干的粉末。这些载体的例子为水、盐水、林
格氏液、右旋糖溶液、和1-10%的人血清白蛋白。也可以使用脂质体
性载体如固定的油。载体或冷冻干燥的粉末可以含有维持等渗
甘露醇)和化学稳定性(如缓冲剂和防腐剂)的添加剂。该
技术灭菌。
位或容器。在这些药物组合物中，活性成分的量一般为基于组合物总重量的
约0.5-99.999%(重量)。
和非水
性(如氯化钠、
制剂通过已知或适当
适当的药物担载体描述于本领域的标准参考文献Remington’s
肠胃外施用的制剂可以包含作为常规赋形剂的无菌水或盐水、聚链烷醇
如聚乙二醇、植物油、氢化萘等。可以通过适当的乳化剂或润湿剂和悬浮剂
根据已知方法制备用于注射的水性或油性悬浮液。用于注射的试剂可
毒的、可非口服施用的稀释剂，如水溶液或无菌可注射溶液或
Pharmaceutical Sciences，的最新版本。
以是无
溶剂中的悬浮 液。作为可使用的载体或溶剂，可以使用水、林格氏液、
普通溶剂或悬浮溶剂，可以使用无菌的不挥发油。对于
任意类型的不挥发油和脂肪酸，包括天然或合成
酸；天然或合成的或半合成的甘油单酯或
公知的，包括，但不限于，常规注
气加压的无针头注射设备，和描述
备，在此全文引入上述专利作为参
等渗盐水等；作为
这些目的，可以使用
的或半合成的脂肪油或脂肪
二酯或三酯。肠胃外施用是本领域
射工具、描述于美国专利No.5,851,198的
于美国专利No.5,839,446的激光穿孔器设
考。
本发明进一步涉及通过胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气
管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、鞘内、奥马
耶贮器内、眼内、玻璃体内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、
骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、
膜内、椎管内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、
舌下、鼻内、或经皮方式施用至少一种抗GD2抗体。
GD2抗体的组合物，用于肠胃外(皮下、肌内或
别是以液体溶液或悬浮液施用；用于阴道
施用，例如，但不限于以霜和栓剂
但不限于以片剂或胶囊形式
鼻滴液或气溶胶或某
凝胶、油膏、
骨内、
肾内、视网
直肠、颊部、
可以制备至少一种抗
静脉内)或任意其它施用，特
或直肠施用，特别是以半固体形式
形式施用；用于颊部或舌下施用，例如，
施用；或用于鼻内施用，例如，但不限于以粉末、
些制剂形式施用；或用于经皮施用，例如，但不限于以
洗液、悬浮液或贴剂递送系统施用，同时用化学增强剂如二甲
基亚砜修饰皮肤结构或增加经皮贴剂的药物浓度(Junginger，
“DrugPermeation Enhancement”；Hsieh，D.S.，Eds.，pp.59-
York1994，)在此全文引入作为参考)，或使用
白和肽的制剂应用于皮肤上(WO98/53847)，或
瞬时转运途径，或增加带电药物通过皮肤
用超声，如超声电渗疗法(美国专
et al.收录于
90(MarcelDekker，
氧化剂以便将含有蛋
施加电场以便产生电穿孔等
的迁移率，如离子电渗疗法，或应
利Nos.4,309,989和4,767,402)(上述文献和
考)。
专利在此全文引入作为参
对于肺部施用，至少一种抗GD2抗体组合物优选以到达肺的下气道或
鼻窦的颗粒大小进行递送。根据本发明，至少一种抗GD2抗体可以通过本
领域公知的各种吸入或鼻设备递送，用于通过吸入进行治疗剂的施用。这些
设备可以将气溶胶化的制剂沉积在患者的鼻窦腔或肺泡中，所述设备
量吸入器、喷洒器、干粉产生器、喷雾器等。其它适于指导抗
用的设备是本领域公知的。所有这些设备可以使用适于
散抗体的制剂。这些气溶胶可以由溶液(水性和
等计量吸入器一般使用推进气体并且在吸入时要
包括计
体的肺或鼻施
以气溶胶形式给予分
非水性)或固体颗粒组成。
求作动(见，例如 WO94/16970，WO98/35888)。干粉吸入器如
Inhale Therapeutics出售的装置，TurbuhalerTM(Astra)、
仅举
WO
数例，利用对混合粉末的呼吸作动(US4668218Astra，EP237507Astra，
97/25086Glaxo，WO94/08552Dura，US5458135Inhale，
在此全文引入作为参考)。喷洒器如喷洒器WO94/06498Fisons，
(Mallinckrodt)和喷洒器(Marquest Medical Products)((US5404871Aradigm，
WO97/22376)， 上述参考文献在此全文引入作为参考)从溶液产生气溶
干粉吸入器等产生小颗粒气溶胶。这些商购吸入
适于本发明的实施的具体设备，不准备限
GD2抗体的组合物优选通过干粉
种抗体的施用的吸入设备具
有利的，它可靠、可
如小于约
胶，而计量吸入器、
设备的具体例子是用于代表
制本发明的范围。包含至少一种抗
吸入器或喷雾器递送。用于本发明的至少一
有一些理想的特征。例如，通过吸入设备递送是
重复并且准确。吸入设备可以任选递送小的干颗粒，例
10μm，优选约1-5μm，以便能够较好地呼吸。
可以迫使至少一种抗GD2抗体的悬浮液和溶液在压力下通过喷嘴，从
而产生包括GD2抗体组合物蛋白的喷雾。可以选择喷嘴大小和构型、施加
的压力和送入液体的速度而达到需要的输出量和颗粒大小。可以通过例如连
接于毛细管或喷嘴的电场产生电喷雾。有
GD2抗体组合物蛋白的颗粒大小
2-3μm。
利的是，由喷雾递送的至少一种抗
小于约10μm，优选约1-5μm，最优选约
适用于喷雾器的至少一种抗GD2抗体组合物蛋白的制剂一般包含溶于
水溶液中的抗体组合物蛋白，其浓度为约每毫升溶液约0.1-100mg至少一种
抗GD2抗体组合物蛋白或mg/gm，或其中的任意范围或任意值，例如，但
不限于0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或
mg/gm。该制剂可以包含赋形剂、缓冲剂、等渗试剂、防腐剂、
和优选锌等试剂。该制剂也可以包含赋形剂或用于稳定抗体组
剂，例如缓冲剂、还原剂、填充蛋白(bulk protein)或碳
抗体组合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、鱼精蛋
蛋白的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露醇、
组合物蛋白制剂也可以包含表面活性剂，
溶胶时的雾化导致的表面诱导的抗
的表面活性剂，例如聚氧乙
酯。其含量一般为制
活性剂为聚氧乙烯失
等。公知的用于
以包含在制剂
24、
100mg/ml或
表面活性剂
合物蛋白的试
水化合物。用于配制
白等。用于配制抗体组合物
乳糖、海藻糖、葡萄糖等。抗体
它可以减少或防止由于溶液形成气
体组合物蛋白的聚集。可以使用各种常规
烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸
剂重量的约0.001-14%。用于本发明的特别优选的表面
水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20
GD2抗体或其特定部分或变体的蛋白制剂的其它试剂也可
中。
抗体组合物蛋白可以通过喷洒器施用，例如射流喷洒器或超声喷洒器。
一般地，在射流喷洒器中，用压缩气体源通过一个孔而产生高速气体射流。
当气体膨胀超过喷嘴时，产生低压区，该区将抗体组合物蛋白溶液拉
拽通过 与液体储存器连接的毛细管。通过毛细管的液体流出管时被剪
细丝和微滴，产生气溶胶。可以使用各种构型、流速和
定的射流喷洒器达到需要的性能特征。在超声喷
振动、机械能，一般采用压电式换能器。
至抗体组合物蛋白，产生包含抗体
递送的抗体组合物蛋白的颗
2-3μm。
切成不稳定的
挡板类型，以便用给
洒器中，采用高频电能产生
该能量被直接或通过耦合流体转移
组合物蛋白的气溶胶。有利地，由喷洒器
粒大小小于约10μm，优选约1-5μm，最优选约
适用于喷洒器，包括射流喷洒器或超声喷洒器，的至少一种抗GD2抗
体制剂的浓度一般为每毫升溶液约0.1-100mg至少一种抗GD2抗体蛋白。
该制剂可以包含赋形剂、缓冲剂、等渗试剂、防腐剂、表面活性剂和优选锌
等试剂。该制剂也可以包含赋形剂或用于稳定至少一种抗GD2抗体
蛋白的试剂，例如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或碳水化合物。
一种抗GD2抗体组合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、
制至少一种抗GD2抗体的典型碳水化合物包括
糖、葡萄糖等。至少一种抗GD2抗体制
减少或防止由于溶液形成气溶胶时
GD2抗体的聚集。可以使用各种
和醇，以及聚氧乙烯山梨糖
0.001-4%。用于本发明的特
油酸酯、聚山梨醇酯
其它试剂是本领域公
组合物
用于配制至少
鱼精蛋白等。用于配
蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻
剂也可以包含表面活性剂，它可以
的雾化导致的表面诱导的至少一种抗
常规的表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯
醇脂肪酸酯。其含量一般为制剂重量的约
别优选的表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨糖醇单
80、聚山梨醇酯20等。用于配制蛋白如抗体蛋白等的
知的，也可以包含在制剂中。
在计量吸入器(MDI)中，推进剂、至少一种抗GD2抗体和任意赋形剂或
其它添加剂作为包含液化压缩气体的混合物被装在一个小罐中。计量阀的作
动释放作为气溶胶的混合物，优选含有大小小于约10μm，优选约1-
最优选约2-3μm的颗粒。需要的气溶胶颗粒大小可以通过使用由本5μm，
领域技术 人员公知的各种方法，包括射流研磨、喷雾干燥、临界点浓缩
抗体组合物蛋白制剂而获得。优选的计量吸入器包括由
且使用氢氟碳推进剂的那些。
等方法产生的
3M或Glaxo制造并
计量吸入器装置中使用的至少一种抗GD2抗体制剂一般包含精细分割
的粉末，其中含有作为非水介质中的悬浮物的至少一种抗IL-6抗体，例如，
在表面活性剂的帮助下悬浮于一种推进剂中。用于此目的的推进剂可
何常规材料，如氯氟碳、氢氯氟碳、氢氟碳或烃，包括三氯氟
氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷、HFA-
HFA-227(氢氟链烷-227)等。推进剂优选是氢氟
使至少一种抗GD2抗体作为悬浮物稳定
受化学降解等。适当的表面活性剂
酸等。在一些情况下，使用
的用于蛋白制剂的其
以是任
甲烷、二氯二
134a(氢氟链烷-134a)、
碳。可以选择表面活性剂以
在推进剂中，从而保护活性试剂免
包括山梨糖醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油
乙醇等溶剂的溶液气溶胶是优选的。本领域已知
它试剂也可以包含在制剂中。
本领域的普通技术人员将认识到，本发明的方法可以通过本文中没有描
用于口服施用的制剂依赖于佐剂(如间苯二酚和非离子型表面活性剂如
聚氧乙烯油酯和正十六烷基聚乙烯酯)的共同施用而人工增加肠壁的通透
性，并且依赖于酶抑制剂(如胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟代硫酸酯(DFF)和
抑肽酶)的共同施用而抑制酶促降解。用于口服施用的固态剂型的活性组成
化合物可以与至少一种添加剂混合，所述添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、
甘露醇、海藻糖、棉籽糖、麦芽糖醇、右旋糖苷、淀粉、琼脂、藻酸
几丁质、脱乙酰壳聚糖、果胶、黄芪树胶、阿拉伯树胶、
白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。这些剂型
的添加剂，如非活性稀释剂、润滑剂如硬脂酸镁、
述的装置对至少一种抗GD2抗体组合物进行肺部施用而达到。
盐(arginates)、
明胶、胶原、酪蛋
也可以包含其它类型
对羟基苯甲酸酯、防腐剂
胱氨酸、崩解剂、粘合剂、
剂等。
如山梨酸、抗坏血酸、α生育酚、抗氧化剂如半
增稠剂、缓冲剂、增甜剂、矫味剂、芳香
片剂和丸剂可以进一步加工成肠衣制剂。用于口服施用的液体制剂包括
允许医学应用的乳液、糖浆、酏剂、悬浮液和溶液制备物。这些制备物可以
含有所述领域常用的非活性稀释剂，如水。也已经描述将脂质体用作
和肝素的药物递送系统(美国专利No.4,239,754)。最近，已经
酸(类蛋白)的人工聚合物微球体来递送药物(美国专利
本领域已知美国专利No.5,879,681和美国专利
体化合物也已经用于口服递送生物活性试
胰岛素
使用混合氨基
No.4,925,673)。此外，
No.5,5,871,753中描述的但载
剂。
对于通过粘膜的表面吸收，给予至少一种抗GD2抗体的组合物和方法
包括含有多种亚微米颗粒、粘膜吸附性大分子、生物活性肽和水性连续相的
乳液，它通过达到乳液颗粒的粘膜吸附而促进通过粘膜表面的吸收
利Nos.5,514,670)。适于施加本发明的乳液的粘膜表面可以包
颊、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠施用途径。用
制剂，如栓剂，可以包含赋形剂，例如聚链烷醇、
鼻内施用的制剂可以是固体，并包含例如乳糖作
油性的鼻滴液。对于颊部施用，赋形剂包
化淀粉等(美国专利Nos.5,849,695)。
(美国专
括角膜、结膜、
于阴道或直肠施用的
凡士林、可可油等。用于
为赋形剂；或可以是水性或
括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶
对于经皮施用，将至少一种抗IL-6抗体包被于递送装置，如脂质体或
聚合纳米颗粒、微颗粒、微胶囊或微球体中(除非特别指出，统一称作微颗
粒)。适合的装置已知有许多，包括由以下成分
如多羟基酸，如聚乳酸、聚乙醇酸及其共组成的微颗粒：合成聚合物
聚物、聚原酸酯、聚酐和聚磷腈， 以及天然聚合物如胶原、聚氨基酸、
及其组合(美国专利白蛋白和其它蛋白、藻酸盐和其它多糖、
Nos.5,814,599)。
有时可能需要在长时间内向受试者递送本发明的化合物，例如，自单次
施用起一周至一年的周期。可以使用各种缓释、储存或植入剂型。例如，剂
型可以包含化合物的可药用的无毒盐，该化合物在体液中具有低溶解
如，(a)多价酸的酸加成盐，所述酸例如磷酸、硫酸、柠檬酸、
拍酸、藻酸、聚谷氨酸、萘单或二磺酸、聚半乳糖醛酸
子的盐，所述阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、
有机阳离子如N,N’-二苄基-乙二胺或乙二胺形成
合物，如鞣酸锌盐。此外，本发明的化合物或优
述的化合物和盐，可以与例如芝麻油等适
脂酸铝凝胶等凝胶中。特别优选的
于注射的缓释储存制剂的另
物或盐，所述化合物或盐位
述于美国专利
对不溶的盐，
中，特
度，例
酒石酸、鞣酸、
等；(b)多价金属阳离
铜、钴、镍、镉等，或与
的盐；或(c)，(a)和(b)的组
选相对不溶的盐，如前面描
于注射的物质一起配制于例如单硬
盐是锌盐、鞣酸锌盐、双羟萘酸盐等。用
一种类型包含用于包被于胶囊中的分散的化合
于缓慢降解、无毒、非抗原性的聚合物中，如描
No.3,773,919的聚乳酸/聚乙醇酸聚合物。该化合物或优选相
如前面描述的化合物和盐，也可以配制于胆固醇基质硅橡胶丸
别是用于动物。其它缓释、储存或植入制剂，如气体或液体脂质体是
文献中公知的(美国专利Nos.5,770,222和“Sustained and Controlled Release
Drug Delivery Systems”，on ed.，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，
1978)。
在此明确地通过提述并入本申请引用的所有参考文件(包括文献参考文
件、授权的专利、公布的专利申请、以及共同待审的专利申请)的内容。
在下文对示例性的实施方案的描述过程中本发明的其他特征可变得自
下面的“材料和方法”在下文中的实施例中使用。
材料和方法
细胞培养物和人组织人神经母细胞瘤细胞系LAN-1由Robert Seeger
博士(Children’s Hospital of Los Angeles，Los Angeles，CA)提供，NB1691由
Peter Houghton博士( Children's Research Hospital，Memphis，TN)提
供。NK-92MI获自American Type Culture Collection(ATCC)，Manassas，
使所有细胞系在5%CO2培养
South Logan，UT)、2mM
的RPMI1640培养基]
Center(MSKCC)获得
速冻。遵照MSKCC
了书面知情同意。
明，这些描述只是为了示例说明本发明而不意在限制本发明。
VA。
箱中在F10[补充有10%胎牛血清(Hyclone，
谷氨酰胺、100U/ml青霉素、和100ug/ml链霉素
中37°C下生长。将在Memorial Sloan-Kettering Cancer
的不同组织学类型的正常组织和实体瘤样品在液氮中
机构审查委员会的指南从患者和/或他们的监护人获得
单克隆抗体鼠3F8是一种具有κ轻链的小鼠IgG3抗体(Cheung et al.，
1985，Cancer Res45，2642-9)。与神经母细胞瘤具有反应性的单克隆抗体
3F8(小鼠IgG3，κ)、5F11(小鼠IgM，κ)和8H9(小鼠，κ)先前已经有描述
(Cheung et al，1985，同上;Cheung et al.，2004，J Nucl Med45，867-
et al.，2001，Cancer Res61，4048-54)。它们作为腹水产生并
纯化：对于3F8为蛋白A(GE Healthcare，Piscataway，
白G，而对于5F11为C1q-sepharose(Pierce，Rockford，
SDS-PAGE为>90%纯。如先前所述通过胃蛋白酶消
(Cheung et al.，1988，J Clin Invest81，
77;Modak
通过亲和色谱
NJ)，对于8H9为蛋
IL)。这些抗体根据
化制备了F(ab')2片段
1122-28)。抗GD2杂交瘤ME361及 TIB114(N.S.7)，一种分泌IgG3对
自BD Biosciences，
Lexington，MA的
购自
照抗体的杂交瘤，获自ATCC。14.G2a购
San Jose，CA。嵌合14.18由Lexigen Pharmaceuticals，
Stephen Gillies博士惠赠。MAB1027(anti-B7-H3MoAb)
R&D System，Minneapolis，MN。针对GD2特异性的小鼠IgG3抗体
hu3F8-IgG1、hu3F8-IgG4、ch3F8-IgG1、和ch3F8-IgG4抗体产生系的
构建。基于m3F8的人同源物，将m3F8的重链和轻链二者的CDR序列嫁接
到人IgG1框架中并加以优化。从两个重链基因和两个轻链基因设计了4个
版本的hu3F8。合成这些hu3F8基因并针对CHO细胞优化(Blue Heron
Biotechnology，Bothhell，WA或Genscript，Piscataway，NY)。使用
载体(Eureka，CA)将这些hu3F8的重链和轻链基因转染到
G418(InVitrogen，CA)选择。当转染到Mage1.5CHO细
产生了特殊的IgG糖形(glycoform)。类似地将小
IgG1和IgG4框架上以制作ch3F8-IgG1和
S220-51购自Northstar Bioproducts，Cape Cod，MA。
bluescript
DG44细胞中并用
胞(Eureka，CA)中时，
鼠VH和VL序列嫁接到人
ch3F8-IgG4重组抗体。
hu3F8与ch3F8的纯化将Hu3F8与ch3F8产生系在Opticho无血清
0.15
培养基(InVitrogen，CA)中培养并收集成熟的上清液。蛋白A亲和柱用含
NaCl，pH8.2的25mM柠檬酸钠缓冲液预
柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，pH3.9洗脱并在
化(1:10v/v比)。使其通过Sartobind-Q膜
NaCl、pH8.2中的5-10mg/ml。对hu3F8-
M NaCl，pH8.2中及PBS pH7.4中
件下进行稳定性研究。
平衡。将结合的hu3F8用0.1M
25mM柠檬酸钠，pH8.2中碱性
并浓缩到25mM柠檬酸钠、0.15M
IgG1分别在25mM柠檬酸钠、0.15
在有或无0.7mg/ml吐温80(Sigma)的条
SDS-PAGE将每种蛋白质2ug在非还原性或还原性条件下进行
SDS-PAGE分析，使用4-15%Tris-甘氨酸速成凝胶系统(Ready Gel System)
(Bio-Rad，Hercules，CA)。使用Invitrogen SeeBlue Plus2预染色标准品作为
蛋白质分子量标记物。电泳后，使用PIERCE的GelCode蓝色染色试剂对凝
胶染色。使用Bio-Rad Fluor-S MultiImager(Bio-Rad)扫描凝胶，并用
One软件(Bio-Rad)对条带强度定量。 Quantity
通过ELISA定量hu3F8和ch3F8以20ng每孔用GD2包被微量滴定
板。对每个板加入150μl每孔的溶于PBS(稀释剂)的0.5%BSA，在环境温
度下经过至少30分钟以封闭过量的结合位点，然后用PBS洗涤至少3次。
用一批次的纯化hu3F8-IgG1(储存浓度1mg/ml)来构建标准曲线，以0.5
ug/ml起始，后随多个2倍稀释。将100ul的标准品和样品(也2倍稀释)添
加到每个孔中并在37℃温育2.5小时。用PBS洗涤平板5次后，向每个孔
中加入100ul在稀释剂中1:3500稀释后的山羊抗人IgG(H+L)(Jackson
Research Laboratory)并在4℃温育1小时。ELISA颜色反应用色原OPD
(Sigma)，过氧化氢为底物，室温黑暗中显色30min。用
用ELISA读板器
或ug/mg蛋
5N H2SO4终止反应，
MRX(Dynex)读取490的OD。基于该标准曲线，以ug/ml
白计来计算人3F8上清液的量。
Biacore T-100生物传感器(Biacore AB of GE Healthcare，Uppsala，
Sweden)上的体外结合动力学CM5传感器芯片(研究级别)和相关的试剂
购自Biacore USA(Piscataway，NJ)。神经节苷脂GM1来自ALEXIS
Biochemicals(AXXORA LLC，San Diego，CA)，GD2来自Advanced
ImmunoChemical(Long Beach，CA)。GM1溶于(0.5mg/ml)90%乙醇、10%
甲醇(v/v)，GD2溶于(0.5mg/ml)乙醇。通过疏水相互作用将神经节苷脂直接
固定化到CM5传感器芯片上。参比表面固定GM1。GM1用100%乙醇1:1
稀释，然后在HBS-E缓冲液(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、及
EDTA)中1/5稀释。将经稀释的3mM
GM1(50μg/ml)以15μl/min的流速历时20 分钟注射(300μl)。然后用
洗涤5次)，直到获得稳定
化。GD2和GM1用
的混合物在HBS-E
EDTA)中1/5稀释。
μl/min流速历时
流速20μl洗
10mM NaOH充分洗涤(通常以5μl/min流速20μl
的基线。活性表面用GD2和GM1以1:1比例固定
100%乙醇1:1稀释并以1:1比例混合。将GD2与GM1
缓冲液(10mM HEPES、pH7.4、150mM NaCl、及3mM
将经稀释的GD2与GM1(50μg/ml)混合物(300μl)以15
20min注射。然后用10mM NaOH充分洗涤(通常以5μl/min
涤5次)，直到获得稳定的基线。
在分析之前将纯化的抗GD2MoAbs在含有250mM NaCl的HBS-E缓
稀释到不同浓度(50～1600nM)。2.将样品(60μl)以30μl/min流速历
钟注射到传感器表面上。缔合阶段完成后，在相同的流速下在含有
冲液中
时2分
250mM NaCl的HBS-E缓冲液中监测解离300秒钟。在每个循环结束时，
将表面用50μl20mM NaOH以50μl/min流速再生1分钟，以及用100μl4M
MgCl2以50μl/min流速再生2分钟。用注射样品到固定化GD2
的生物传感器曲线减去在动力学分析之前注射样品到固定化的
获得的对照曲线。利用Biacore T-100评价软件用二价分析物
analyte model)及速率常数的缺省参数设置分析数据，并计算表
速率常数(kon，ka1)、解离关(off)常数(koff，kd1)，以及解离
(KD=kd1/ka1)。
之上后获得
GM1之上而
模型(bivalent
观缔合开(on)
平衡常数
进一步使用大鼠抗3F8抗独特型抗体(Cheung et al.、1993、Int J Can54、
499-505)表征了Hu3F8和ch3F8。还将这些大鼠IgG1抗体消化成Fab片段，
并使用Fab制备试剂盒(Pierce Protein Research Products，
Scientific)加以纯化。用ELISA和BIACORE测定了它们对
的反应性。
Thermo Fisher
ch3F8和hu3F8
对与其他神经节苷脂的交叉反应性的ELISA GD2、GM2、GD1a、
100
GD1b、GT1b、以及GD3、GM3、GM1、GD1a在90%乙醇中以20ng/孔包
被。空气干燥后，用150ul/孔的含0.5%BSA的PBS室温封闭孔1小时，然
后用PBS洗涤3次。一式三份地加入0.5%BSA中的1ug/ml的抗体(每孔
ul)。为了扣减背景，使用了(1)无抗原的孔和(2)无样品的孔。在37℃
小时并用PBS洗涤5次后，使用HRP-山羊抗小鼠
稀释到1:1000)(用于小鼠抗体(例如3F8))或
Laboratory，
用
温育2
IgG(Jackson Laboratory，
HRP-山羊抗人IgG(Jackson
1:1000)(用于人源化抗体)。在4℃再温育1小时并再洗涤后，使
ELISA读板器MRX(Dynex)于490读取OD，并以相对于对GD2的最大
抗体的生物素化将生物素(长臂(Long Arm)-N-羟基琥珀酰亚胺酯
免疫染色确定的组织交叉反应性用冷冻切片机切出5-7微米厚的冷
冻切片，用250ul丙酮在-20℃固定30分钟。用PBS洗涤玻片之后，使玻片
在室温下暴露于新鲜配制的0.1%过氧化氢15分钟。洗涤之后，加入封闭性
亲和素溶液(VECTOR亲和素-生物素封闭试剂盒)并在室温温育20分钟。洗
涤之后，加入1滴封闭性生物素溶液(VECTOR亲和素-生物素封闭试剂盒)
并在室温温育20分钟。在进一步洗涤之后，加入>100ul封闭血清(在
中新鲜稀释的10%马血清)并在室温温育1h。这一步可以更长。注意：
重复使用血清。从每个玻片吸出封闭血清后，加入100ul在1%马血
释的1ug/ml生物素化MOPC21(阴性对照)或生物素化抗体并
小时。洗涤之后，加入100ul在PBS中1:100稀释的亲和素-
(BNHS，Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)以50mg/ml浓度溶解
于二甲基亚砜(DMSO)中。以试剂对抗体1/10的重量比加入生物素化试剂。
在不时搅动下，室温温育反应混合物2小时。将生物素化的抗体在PBS中
室温透析4小时或4℃透析过夜。将生物素化抗体的免疫反应性与天然抗体
比较，并确保二者的EC50相互在20%之内。
结合的%来表示交叉反应性。
PBS
不能
清中稀
在室温温育1
生物素复合物 [ABC](Vectastain ABC试剂盒，VECTOR)并在室温温
向每个切片添加200ul染料(DAB过氧化氢酶底
色发色2分钟(直到根据标准品中的发色
动的自来水中洗涤切片5分钟并用
在流动的自来水中洗涤5分钟。将
100%的乙醇中脱水。最后的脱水
入1滴新鲜的Cytoseal，然
育30分钟。洗涤之后，
物试剂盒，VECTOR)并让颜
判定达到了期望的染色强度)。在流
储存的Myer’s苏木精复染，然后进一步
玻片顺序地在75%、然后95%，再然后
步骤在二甲苯或二甲苯替代剂中进行。加
后用盖玻片密封切片。
直接细胞毒性测试了抗体在没有人血清或人效应细胞存在时对肿瘤
细胞生长和生存的直接影响。将肿瘤靶物用2mM EDTA或胰蛋白酶-EDTA
解离，洗涤，并以1.2x103至3.5x104/孔播种在96
在CO2培养箱中孔平底平板中的F10中。
5%CO2、37℃温育24小时后，对各个孔中加入递增浓度的
溶于F10的抗体。对照孔仅接受F10。5%CO2中37℃温育72
个孔加入WST-8试剂并在
ELISA读板
(Sigma)
数来验
小时后，对每
CO2培养箱中37℃黑暗中温育2-6小时。使用
器MRX(Dynex)在450nm和690nm读取OD。通过使用台盼蓝
或Beckman Coulter计数仪(Beckman Coulter，Brea，CA)直接细胞计
证WST-8测定。
借助51Cr释放的抗体依赖性细胞细胞毒性
(ADCC)将靶细胞用2mM
EDTA解脱到不含Ca2+和
Mg2+的PBS中，并用含10%小牛血清(Gibco)的
RPMI1640(F10)洗涤。将100μCi的51Cr与106个靶
37℃温育1小时，其中每隔15分钟轻柔地使沉
在250ul F10中重悬浮并在37℃温育30
盼蓝(Sigma)测定存活力，并快速
细胞在终体积250μl中
淀重悬浮。然后洗涤细胞并
分钟。洗涤后，计数细胞并使用台
播种到96孔U底平板上。将来自正常志愿 者的外周血收集到肝素化管
温20分钟以使红细胞沉降。
周血单个核细胞(PMBC)和
PMN-ADCC。用F10洗涤
下进行PBMC-
的最终体积为
将平板在室温
中。将血液与3%右旋糖酐/PBS混合并保持于室
然后用菲柯尔(ficoll)处理白细胞，并分离成外
粒细胞(PMN)，分别用于PBMC-ADCC和
细胞，计数，并测定存活力。在10U/ml IL-2存在
ADCC，在2ng/ml GMCSF存在下进行PMN-ADCC。ADCC
250ul/孔。将抗体在F10中从1ug/ml起进行3倍或5倍稀释。
500rpm短暂旋转离心，然后在37℃、5%CO2培养箱中温育
4小时。收集ADCC上清液中释放的51Cr用于γ计数。使用
总释放，并使用没有效应物的单独F10测定背景自发释放。
的E:T比。类似地，使用稳定转染了人CD16或人
细胞进行ADCC测定。与PBMC或PMN不同，
E:T比通常保持在20:1。
10%SDS测定
一般使用50:1
CD32Fc受体的NK92-MI
该测定中不需要细胞因子。
抗体的碘化利用iodogen法(Divgi et al.，2007，Lancet Oncol.8，304-10)
用124I和131I进行碘化。用50μg iodogen包被玻璃
酸盐缓冲液(pH7.4)中的100μg IgG与1mCi的
在MSKCC利用回旋
10mCi的
管形瓶，并将50mM磷
124I(或131I)一起加入。碘124
加速器现场制作。在反应管形瓶中将0.05M NaOH中的
124I(0.02-0.05mL)与1mg MoAb(～0.5mL)、0.063mL1M Tris碱
和0.4mL0.2M磷酸钠pH7.4混合。让反应在冰上进行
溶液，用P6大小排阻柱，含1%BSA的PBS作为洗脱
谱进行纯化。
15分钟，然后移出
液，通过大小排阻色
放射免疫测定(RIA)
用Lindmo的方法来估计免疫反应性(Lindmo et al.，1984，J Immunol
MoAb在异种移植小鼠中的生物分布
使用异种移植了皮下LAN1神经母细胞瘤肿瘤的无胸腺裸小鼠来研究
药动学/生物分布和抗肿瘤性质。用卡尺测量肿瘤。当皮下肿瘤达到～
时启动实验。每只小鼠静脉内注射～100uCi的放射性碘化抗体，且
48小时时处死动物，取出它们的器官并用γ计数器
Perkin Elmer)计数。这些器官包括皮肤、肝脏、
小肠、大肠、膀胱、股骨、肌肉、肿瘤、
器官中积累的uCi以及器官重量，
了%ID/gm的肿瘤对正常组织比。
Methods72，77-89)。将放射标记的MoAb用1%BSA稀释到50μl含有大约
15,000-20,000cpm(约1-1.5uCi/3ml)。将50μl加入到含6.25、3.75、2.5、
2.2、1.9百万个肿瘤细胞的500μl0.5BSA中并在环境温度下混合1小时。
在1500rpm离心5分钟后移出上清液并用1ml冰冷的0.5%BSA洗涤。再
次在1500rpm离心5分钟后，在γ计数器中计数细胞离心沉淀。减去在没
有细胞或碘化抗体的存在下的背景计数，并使用Lindmo法估计免疫反应性
(Lindmo et al.，1984，同上)。
200mg
通常在
(Packard Instruments，
脾脏、肾脏、肾上腺、胃、
心脏、肺、脊柱、以及脑。基于在
计算了%注射剂量(ID)/gm小鼠。还计算
糖分析
由Complex Carbohydrate Research Center，Athens，GA进行了抗体的单
MS
实施例1
糖和寡糖分析。单糖分析通过HPAEC测定。N-糖苷谱分析通过MALDI-
进行。
嵌合IgG1和四种人源化Igg1的氨基酸序列。将m3F8的重链和轻
链的CDR嫁接到人IgG1框架上，基于它们各自对人框架IGG HV3-33和
IGKV3-15的同源性。根据两种重链和两种轻链设计，基因合成了4个版本
的hu3F8并在DG44细胞中表达。嵌合人重链和
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，人源化重
NO:4，huH2-gamma1示于
SEQ ID NO:5，而huL2-
轻链的氨基酸序列分别示于
链序列huH1-gamma1示于SEQ ID
SEQ ID NO:6，人源化轻链序列huL1-kappa示于
kappa示于SEQ ID NO:7。
当表达为完整IgG时，四种hu3F8-IgG1命名为hu3F8-H1L1-IgG1、
H1L2-IgG1、hu3F8-H2L2-IgG1和hu3F8-H2L1-IgG1。制作了用人IgG4
框架替代m3F8和hu3F8-H1L1-IgG1的重链序列(嵌合重链γ4、
hu3F8-
SEQ ID NO:4 和人源化3F8重链γ4、SEQ ID NO:8)的其他构建物，用
到DG44细胞中。在另一组实验中，将hu3F8-H1L1-
殊的经过特殊的糖基化签名选择的
中。嵌合和人源化3F8都是使用
bluescript载体转染
IgG1序列转染到一种特
MAGE1.5CHO细胞系(见“材料与方法”)
标准蛋白A亲和色谱纯化的。
在SDS凝胶上，嵌合和人源化抗体作为具有合适大小的重链和轻链的
IgG迁移；而且在HPLC上它们都作为完整的IgG洗脱，聚集物形成
据未显示)。在ELISA中它们都以相似的亲合力结合GD2。在
(LAN-1，数据未显示)中抗体显示最优的抗体浓度(～0.1-1ug/
在此浓度之外由于较高抗体浓度下的细胞死亡而平均荧
对于M14黑素瘤，在超过1ug每百万细胞的过量抗体
亡(数据未显示)。IgG4倾向于具有较低的MFI，
IgG1的优先反应性。与其他hu3F8构建体相比，
最为稳定，在FACS和ELISA中都保留其对肿
<10%(数
FACS分析
百万个细胞)，
光强度(MFI)下降。
条件下未发生细胞死
原因是荧光第二抗体与人
hu3F8-H1L1-IgG1在冻融后
瘤细胞的结合(数据未显示)。 根据糖分析，hu3F8-IgG1n主要具有甘露
之相对的是，hu3F8-IgG1和hu3F8-IgG4
乙酰-葡糖胺(表1)。
糖，以及一些N-乙酰-葡糖胺，与
含有几乎等摩尔比的岩藻糖和N-
实施例2
基于SPR(BIACORE)的亲合力测量
将GD2包被到CM5芯片上，使用BIACORE T-100通过表面等离子体
共振在低GD2密度下比较了抗体结合的动力学(kon，koff和KD)(表2)。在
高GD2密度下所有抗体的koff和KD均成比例地提
BIACORE CM5芯片上在低GD2密度(数据未显示)和高
示)下的不同抗体浓度的代表性抗体的传感图进行比较。
高(数据未显示)。对
GD2密度(数据未显
表1：单糖组成
抗体的缓慢的koff导致当抗体与GD-2阳性肿瘤细胞反应时的洗去
(washoff)较慢。这里，将LAN-1细胞(数据未显示)或M14细胞(数据未显示)
与单克隆抗体反应并用洗涤缓冲液洗涤多次。在每次洗涤时，使用第二种
FITC标记的山羊抗小鼠抗体检测细胞表面上残余的抗体。MFI作为基线(即
第一次洗涤之后)的百分比表示。在LAN-1细胞上，3F8和抗B7-H38H9抗
体相比于14.G2a(～30%保留，数据未显示)具有
保留)。类似地，对于M14肿瘤细胞，到
的保留存在实质性的差异。3F8、3F8-
的koff)
缓慢的洗去(10次洗涤后～80%
第5次洗涤时，肿瘤细胞上的抗体
(Fab’)2和hu3F8-IgG1(它们都具有缓慢
具有>80%的保留，而其他抗GD2抗体14.G2a(mIgG2a)、ME361
(mIgG2a)、和S220-51(mIgG3)(它们都具有快速的koff，根据
漏至<30%。Hu3F8-IgG1、hu3F8-IgG4、ch3F8-IgG1和
中及通过SPR(见“方法”)与大鼠抗3F8独特型抗
J Cancer54，499-505)以及它们的Fab以
BIACORE)渗
ch3F8-IgG4也在ELISA
体(Cheung et al.，1993，Inter
高亲合力特异性反应。
实施例3
与其他抗原的交叉反应性
在交叉反应性研究中，hu3F8-H1L1-IgG1具有与ch3F8-IgG1和m3F8
概貌(表3)。与GD1b存在低水平的交叉反应性，表达为ELISA中相
相GD2的OD的OD百分比。Western或SPR均显示m3F8、hu3F8
14.G2a与人N-CAM无交叉反应性(Patel et al.，1989，60，
表2:SPR(BIACORE-T100)测量的嵌合和人源化3F8的结合动力学
861-866)(数据未显示)。
相似的
对于固
或
w> IgG1n
实施例4
直接细胞毒性
当这些抗体体外添加到神经母细胞瘤细胞时，它们诱导直接细胞死亡并
减慢体外细胞生长。在3日培养系统中通过WST-8测定时，比较m3F8和
hu3F8的EC50可见二者具有相似的效力(见表4)，与它们相对
照的是，14.G2a
大约弱10倍。
表3:ELISA测定的与其他神经节苷脂的交叉反应性
实施例5
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
使用志愿者PMBC(数据未显示)和志愿者PMN(数据未显示)作为效应
ADCC测定中比较了四种hu3F8IgG1抗体(H1L1、H1L2、H2L1、H2L2)。
表4:抗体存在下的神经母细胞瘤LAN-1的直接细胞毒性
Hu3F8-H1L1-IgG1(缩写为hu3F8-IgG1)在体外最为稳定，选择其用于进
物，在
除了H1L2之外的所有三种hu3F8具有可比较的PBMC-ADCC。但最重要的
是，它们全部>10-100倍优于m3F8。
一步表征。使用PMBC(数据未显示)或PMN(数据未显示)作为效应物，在
针对LAN-1的ADCC测定中比较了Ch3F8-IgG1、hu3F8-IgG1、hu3F8-
14.G2a、和m3F8。这些抗体的ADCC效力作为(3F8的
之比来计算(表5)。相对于m3F8，hu3F8-IgG1
在PMN-ADCC中强19倍。hu3F8-IgG1n
嵌合和人源化3F8达到的最大细胞毒性
14.G2a，无论是PBMC-ADCC或是
IgG1n、
EC50)/(MoAb的EC50)
在PBMC-ADCC中强217倍，
则分别强3901倍和5倍。此外，
实质性地且一致性高于m3F8或
PMN-ADCC。
为了考察MoAb在ADCC中对孤立的单独FcR(在没有抑制性FcR的存
在下)的能力，我们使用了NK92细胞了测试ADCC。NK92细胞在其细胞表
面上不携带人FcR。当用人CD16和CD32转染时，它们能够介导高效的
ADCC。当用神经母细胞瘤LAN-1靶物测试这些效应物细胞时，在
CD16-ADCC中hu3F8-IgG1n的效率实质性地(～10倍)高于hu3F8-IgG1，而
hu3F8-IgG1的效率高于m3F8(12倍)(数据未显示)。与之相对照的是，用
CD32作为FcR时，hu3F8-IgG1的效力比hu3F8-IgG1n高将近10倍(数据未
显示)。当使用黑素瘤M14作为靶物时观察到了类似的趋势。在CD16-
中，Hu3F8-IgG1n的效率比hu3F8-IgG1或ch3F8-IgG1高大约10倍，
hu3F8-IgG1或ch3F8-IgG1的效率比mu3F8或14G.2a高大约20倍(数
示)。与之相对照的是，当FcR为CD32时，hu3F8-IgG1、
ch3F8-IgG1相似，在CD32-ADCC中都比m3F8效率高
亚类抗体具有<3%的CMC活性，最小的
好的C32-ADCC。
ADCC
而
据未显
hu3F8-IgG1n和
>10倍(表6)。IgG4
CD16-ADCC活性，但比m3F8更
实施例6
补体介导的细胞毒性
在人补体介导的裂解(CMC)中，不同的hu3F8IgG1形式(H1L1、H1L2、
表5:在ADCC和CMC中针对神经母细胞瘤LAN-1的相对抗体效力
H2L1、和H2L2)的效率相近(表6)。在CMC中Ch3F8与hu3F8为m3F8的
40-60%，而14G.2a与ch14.18为4-12%(表6)。
实施例7
靶向人神经母细胞瘤异种移植物
用131I放射性标记的Hu3F8-IgG1、hu3F8-IgG1n、和hu3F8-IgG4具有
近似的免疫反应性，大约40-45%(表7)。将它们在携带皮下LAN-1神经母
细胞瘤异种移植物的小鼠中48小时时的生物分布与131I-m3F8
当以%ID/gm量度时，肿瘤摄取在hu3F8-IgG1(29.6%)
是近似的，二者均大约二倍于hu3F8-IgG1n和hu3F8-
于NB LAN-1异种移
比之下，对于
织比均与
进行了比较。
与m3F8(28.6%)之间
IgG4(数据未显示)。对
植物而言这四种抗体的肿瘤对正常组织比是近似的。相
黑素瘤M14，所有三种hu3F8抗体的%ID/gm和肿瘤对正常组
m3F8相似(数据未显示)。
表6:在ADCC和CMC中针对黑素瘤M14的相对抗体效力
实施例8
对神经母细胞瘤异种移植物的治疗
用m3F8或hu3F8-H1L1-IgG1静脉内处理异种移植了已建立的人神经母
性
细胞瘤LAN-1(0.5-1cm直径)的小鼠，每周2次历时4周。对肿瘤响应和小
鼠生存进行监控。肿瘤生长的延迟对hu3F8-H1L1-IgG1抗体剂量具有依赖
(200ug>100ug>20ug，数据未显示)。接受100-200ug的小鼠的
地长于(p=0.003)接受PBS对照或m3F8的小鼠(数据未显示)。 生存显著
表7:生物分布研究中131I标记的抗体的RIA
w>
讨论
抗GD2抗体是一种已得到证实的GD2阳性神经母细胞瘤的治疗手段
(Yu et al.，N Engl J Med363:1324-1334，2010)。鼠抗体14.18及其衍生物
(14.G2a和ch14.18)已经为将来抗GD2疗法的改进提供了标尺。我们选择了
鼠IgG3抗体m3F8进行临床开发的原因是其在GD2结合过程中的
14.G2a或ch14.18慢10倍。在具有骨髓中化疗抵抗性
瘤的患者中，m3F8加GMCSF诱导了80%完全
J Clin Oncol19，4189-94)。然而，人抗小
其抗原的结合能力、阻断该抗体的直接作
从而减弱鼠抗体的作用。通过基因
能减少HAMA应答。
在患者中具有最小的
在的下一代抗
koff比
的转移性神经母细胞
的缓解(Kushner et al.，2001，
鼠抗体(HAMA)可以中和鼠抗体对
用、并加速抗体从循环中的清除，
工程来将鼠IgG框架改变为人IgG框架可
Ch14.18与hu14.18(二者均衍生自14.G2a的VH和VL)
免疫原性。因此我们将3F8的嵌合和人源化形式作为潜
GD2抗体进行了测试。
嵌合化和人源化的成功标准之一是在基因工程过程中保持亲和力。这对
于人源化过程中的CDR移植是尤其不确定的。ch3F8和hu3F8保留缓慢的
koff是令人放心的。但更重要的是，体外效应物功能，以及体内
及体内治疗性能的保持和增强可能是关键的。ch3F8-IgG1和
显示效率高于m3F8>200倍的PBMC-ADCC，而
外，特殊的糖形hu3F8-IgG1n的PBMC-
PMN-ADCC效率比m3F8高5倍。
和hu3F8的补体活化能力
肿瘤靶向以
hu3F8-IgG1均
PMN-ADCC为>20倍。此
ADCC效率比m3F8高>3500倍，
与之形成鲜明对照的是，对于CMC，ch3F8
比m3F8低。
鉴于近来关于ADCC在单克隆抗体在患者中的抗肿瘤效果中所起作用
的证据，ADCC的这种大幅改善是最为理想的。在使用利妥昔单抗
治疗的淋巴瘤患者中，高亲和力FcR2A和FcR3A均显示具有
生存优势(Weng and Levy，2003，J Clin Oncol21，
体FcR3A在体外ADCC中导致的改进
10，6248-55)，但总体响应和进展
同上)。当用赫赛汀
的患者的总体响应更
(rituximab)
更好的响应和
3940-7)。虽然高亲和力受
<10(Niwa et al.，2004，Clin Cancer Res
前时间改善了200%(Weng and Levy，2003，
(Herceptin)治疗转移性乳腺癌时，具有高亲和力FcR3A
好(83%对35%，p=0.03)，且无进展生存更长 (p=0.005)(Musolino et al.，
2008，J Clin Oncol26，1789-96)。对于用Cetuximab
治疗的转移性结肠直肠癌，具有低亲和力FcR2A和FcR3A的患者与具有突
变的KRAS的患者具有近似的危险比例(Bibeau et al.，2009，J clin Oncol27，
1122-9)。对于鼠3F8，在髓样细胞上具有对m3F8的高亲和力FcR3A
患者显示具有更好的存活(Cheung et al.，2006，J Clin Oncol24，
受体的
2885-90)。
虽然结合亲和力和效应物功能对治疗应用而言是关键的，但交叉反应性
对
会造成预料之外的毒性问题。我们用纯化的神经节苷脂进行ELISA，以及
一组正常人组织进行免疫组织化学，显示了这些嵌合和人源化3F8
与鼠3F8近似的交叉反应模式(数据未显示)。与m3F8相似，
3F8形式与GD2相比显示对GD1b的低水平反应性。
经母细胞瘤肿瘤中高度普遍的神经节苷脂，尤其
分化而来时(Hettmer et al.，2004，
Brain125，2491-506)。这可
母细胞瘤的免疫疗法
体也已与感觉性共济
形式具有
嵌合和人源化
已经显示GD1b是在神
是当其由视黄酸类(retinoids)
Br J Cancer91，389-97;Gong et al.，2002，
能是有意义的，因为对于接受针对高风险的神经
的患者给予顺式视黄酸是常规做法。但是，抗GD1b抗
失调神经病变联系起来(Gong et al.，2002，同上)。无论 如何，在超过
应性)且没有500名患者中m3F8的安全性概貌(与GD1b具有相似的交叉反
长期的或迟发的感觉神经病变，这是令人放心的。
补体介导的细胞毒性(CMC)对于人神经母细胞瘤异乎寻常地有效
(Saarinen et al.，1985，Proc Amer Assoc Cancer Res26，291)，因为人神经母
细胞瘤对CD55(Cheung et al.，1987，Proc Natl Am Assoc Cancer Res28，387)
和CD59(Chen et al.，2000，同上)的表达低。所有抗GD2抗体均介
的补体介导细胞毒性，且m3F8似乎特别高效。然而，对于利
究提示补体活化在ADCC的下调中起负面作用
5322-30)。在临床研究中，补体组分
法的较差响应关联起来
对于抗GD2抗体，
导高效
妥昔单抗的研
(Wang et al.，2009，Blood114，
C1qA的较高活性被与对利妥昔单抗疗
(Racila et al.，2008，Clin Cancer Res14，6697-703)。
补体活化被认为是疼痛副作用的原因(Navid et al.,Curr
实施例9
利用抗体来阻断急性疼痛副作用
Cancer Drug Targets10:200-209，2010)，也促成了目前处于临床试验中的
Fc-CH2域突变版本(hu14.18K322A)的问世。考虑到这些因素，CMB的亢进
可能不是理想的。ch3F8和hu3F8的CMC效率都稍有降低，这是令人安心
的。
[278]有假说称具有缓慢的koff，但消除了ADCC或CMC活性的抗体
可 以用来阻断包围血管周空间的神经纤维上的GD2。3F8的热处理
除其ADCC和CMC活性，而不影响其GD2结合
Oncol29，1168-1174)。当对大鼠预注射经热处
5-10倍摩尔过量的天然3F8的疼痛响应
(HM3F8)消
(Kushner et al.2011，J Clin
理的3F8时，它们对后续的
被实质性降低。更重要的是，抗肿瘤 效果未受折损。在一项I期临床试
具有抵抗性神经母细胞瘤(NB)的
3F8加粒细胞-巨噬细胞集
有剂量限制性
抗组胺
验中(IRB-05015，NCT00450307)，30名
患者在门诊环境下接受了一至二个周期的
落刺激因子。3F8施用开始时为20mg/m2/d，在没
毒性(DLT)的条件下以20mg/m2/d递增。在先施用包括镇痛剂、
药、以及2mg/m2HM3F8的5分钟输注。将阿片使用与用3F820
mg/m2/d处理但无HM3F8的同时对照组比较。由于药物供应限
终止于160mg/m2/d；即使到这个剂量水平，镇痛
相似，而且没有DTL。3F8剂量水平直到
低于对照。抗NB活性在所
的，并提示HM3F8
制剂量升高
剂的需求仍然与历史对照
80mg/m2/d时的镇痛剂需求仍显著
有剂量下均发生。这种多重3F8剂量升高是可行
可能可以调节毒性而不钝化抗NB活性。
hu3F8-IgG4的疼痛阻断潜力
基于HM3F8的临床结果，我们提出这样的假说，即小剂量的不具有
或ADCC功能的抗体可以优先阻断血管周围的疼痛纤维。虽然加热
破坏其CMC和ADCC功能(而保留结合)，热改性的hu3F8却保留几
的CMC和ADCC功能。hu3F8-IgG4在不同的NB细胞系如Lan1、
SKNLP、BE(1)N和SHEP1中不能活化CMC和ADCC(表8，以及
CMC
m3F8
乎完整
NMB7、
未显示
结构和的数据)，这使得这种抗体亚类成为HM3F8的有效替代者。与对抗体
免疫原性具有未知影响的加热不同的是，hu3F8-IgG4是一种工程化蛋
白。除了不存在CMC和ADCC功能之外，IgG4亚类具有独特的生物化学
性质。它们通常是由慢性抗原刺激诱导的，已知它们可干扰其他抗体同种型
的免疫复合物形成，从而抑制炎症反应(Losen et al.，2008，
1132，174-9)。最重要的是，它天然能够将自身减少为
经过数小时时间后失去其与hu3F8-IgG1竞争的
Ann N Y Acad Sci
单价，从而在血液中
能力(van der Neut Kolfschoten et al.，2007，Science317，1554-7)。这种单
价性来源于其已知的 交换Fab臂的性质：通过与来自另一个IgG4分
链及附接的轻
子的重链-轻链对互换一条重
链(半分子)，导致针对所讨论的特定抗原(例如GD2)的单价性。
大鼠异常性疼痛(allodynia)模型使用大鼠模型来测试hu3F8-IgG4阻
副作用的能力(MSK规程#09-05-010)。使用了m3F8(大鼠补体的高
断疼痛
效活化
和
hu3F8-
物，Bergman et al.，2000，Cancer Immunol Immunother49，259-66)
hu3F8二者来诱导异常性疼痛。在静脉内施用m3F8(5mg/kg)、或
IgG1(5mg/kg)、或ch14.18(5mg/kg)之前30分钟，将Hu3F8-IgG4(0.1、
hu3F8-IgG4对131I-hu3F8-IgG1的生物分布和效力的作用将神经母细
胞瘤(LAN-1)肿瘤皮下植入多组具有低血清IgG的雌性NOD/SCID/IL2-
0.25或0.5mg/kg)作为静脉内推注(iv push)施用。其他组接受了热改性的
m3F8(HM3F8)或对照抗体代替hu3F8-IgG4。在MoAb注射之前和之后利用
Von Frey纤丝法评估基线疼痛(Chassaing et al.，2006，Br J Clin Pharmacol61，
389-97;Benani et al.，2003，Eur J Neurosci18，2904-14)。
gcnull免疫缺陷小鼠(n=10/组)中。在实验前24小时以1gm/kg对小鼠注
射人IgG。
或0.5mg/kg)、
将Hu3F8-IgG4(0.1、0.25或0.5mg/kg)或对照huIgG4(0.1、0.25
或HM3F8(0.5mg/kg)、或盐水作为静脉内推注施用，30
的各MoAb(50uCi/小鼠)跟踪标记的m3F8、分钟后用131I-标记
或hu3F8-IgG1或ch14.18(5
从尾部收集血液。在生物分
mg/kg)。在第1、3、6、12、24、36、48和96h
布研究中，在两个时间点上
以进行组织计
数，数据以百
(131I-MoAb注射之后24小时和48小时)处死小鼠
数。移出主要器官并在具有已知体积的注射物的γ计数器中计
分比Ig/gm组织表示。药动学分析使用WinNonlin软件程序
(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)对血清浓度-时间数据进行非隔
室分析 来进行。在另外的几组实验中，类似地处理异种移植小鼠但没
记，并在2个月时间内随时间测量它们的皮下肿有131I跟踪标
瘤响应。
hu3F8-IgG4阻断大鼠中的异常性疼痛的能力可以与热处理的m3F8的
较。基于所使用的阻断抗体的剂量响应曲线(同时保持天然m3F8、或
IgG1或ch14.18的刺激，均使用5mg/kg)，可以求出在大鼠中阻断异
痛的相对效力。我们预期hu3F8-IgG4阻断异常性疼痛的效率与热处
3F8等同或更高。这些研究将提供将hu3F8-IgG4转化到临床试验的临
实施例10
优化hu3F8框架序列以提高稳定性
在人源化鼠抗体的过程中，常常将结构上重要的位置上的框架残基回复
材料和方法
m3F8可变域的结构模型
利用Discovery Studio(Accerlys，San Diego，CA)中的MODELER(Eswar
床前依据。
能力比
hu3F8-
常性疼
理的
突变成鼠序列以便保持抗体稳定性和抗体结合性(Honegger，A，2008，
Engineering Antibodies for Stability and Efficient Folding，In:Therapeutic
ok of Experimental Pharmacology，181)。
et al.，2006，Curr Prot Bioinfor，Supplement15，5.6.1-5.6.30)创建了m3F8
可变域的同源性模型。选用疟疾抗原AMA1抗体Fab(蛋白质数据库编号
2Q8A)的晶体结构作为可变轻链的模板(84%同一性)。选用抗体13G5Fab(蛋
白质数据库编号2GJZ)的晶体结构作为可变重链的模板。
m3F8Fab片段的晶体结构
使用标准Fab制备试剂盒(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)通过木瓜
蛋白酶消化产生了m3F8的Fab片段。将经纯化的m3F8浓缩到
pH6.5中12mg/ml，然后在悬滴中16℃下通过对含有
D9(含0.1M Tris pH8.5、
CA))的储库进行蒸
溶液而形成的。
冷冻保护液保
20mM HEPES
Hampton Index试剂
25%w/v PEG3350(Hampton Research，Aliso Viejo，
汽扩散来结晶。液滴是通过混合1μl蛋白溶液与1μl储库
用含有25%甘油、0.1M Tris pH8.5、25%w/v PEG3350的
护晶体。在Argonne Advanced Photon Source beamline24IDC
收集数据。晶体属于空间群C2，且衍射至1.7分辨率。
使用Phaser(CCP4套件)(McCoy et al.，2007，J Appl Crystallogr40，
674)及PDB条目2AJU作为检索模型(Qin et al.，2008，J Biol Chem283，
m3F8晶体结构的计算分析
基于人模板IgHV3-33-HC和IGKV3-15-LC，利用计算化学方法对每一
658-
29473-84)通过分子置换来解析Fab结构。对最佳分子置换模型用Refmac5
(Murshudov et al.，1997，Acta Crystallogr.D:llogr53，240-255)
进行细化，并使用O(The CCP4suite:programs for protein crystallography.
Acta Crystallogr.，D:ollogr.50(1994)760-763)进行手动搭模，用
Arp–Warp(Lamzin and Wilson，1993，Acta Crystallogr，D:llogr.
49，129-147)加入溶剂。最终的模型含有两个m3F8Fab多肽链和585个溶
剂分子。
个可能引入到m3F8上的框架中的人源化突变进行了分析。使用CHARMm
(Chemistry at Harvard Molecular mechanics)力场(Brooks et al，2009，
Chem30，1545-1615)模拟m3F8的晶体结构，并根据突变后结构与野生型蛋
白的折叠自由能的差异来计算每个点突变的影响。使用广义玻恩近似来解释
溶剂的影响，且所有的静电项均作为库仑相互作用与对溶剂化能的极
的和来计算。对每个点突变计算范德华力、静电、熵和非极性
所有的计算均使用Discovery Studio3.0(Accelrys，
性贡献
项的加权和。
San Diego，CA)进行。
结果
对于hu3F8-H1L1重链序列，使用人IgG重链序列IgHV3-33-HC作为模
为了验证同源性模型的准确性并进一步改善人源化策略，以1.7解析
m3F8的晶体结构(数据未显示)。将m3F8可变区的同源性模型与经解析
模
的晶体结构叠加(数据未显示)。对于CDR之外的大部分框架区域的同源性
型与实验获得的晶体结构紧密吻合。然而，
尤其是在环H3、H2和L3中。同源性模
面处的对Fv结构的稳定性关键的
键，两对氨基酸参与pi相
基于IgHV3-33-HC
突变的能量效
人源化
了
板，并在第5、9、16、19、20、24、28、29、30、40、48、49、67、71、
76、78、81、86和92位进行了回复突变。对于hu3F8-H1L1轻链，使用人
IgG轻链序列IGKV3-15-LC作为模板，并在第1、7、9、15、19、21、22、
43、45、58、60、67、70、73、78、80和87位进行了回复突变。回复突变
是基于m3F8的同源性模型推断的，包括确定这些突变是否会影响CDR环
的折叠或者影响骨架稳定性(牵涉Gly和Pro的突变)。
在CDR区中观察到显著的差异，
型也未能准确地预测任何VH-VL界
相互作用。有6对氨基酸在VH-VL形成氢
互作用(表10)。在解析了m3F8的晶体结构之后，
与IGKV3-15-LC模板，应用计算分析来确定每个人源化
应。计算了每个突变的折叠自由能差。基于该分析，发现这些
突变中有5个对m3F8的整体折叠而言是失稳性的(见表9)。这些包
第11和21位，以及轻链第1、10、12、40、和97位。还确定了轻
别位于第40和97位的涉及Pro和Gly的人源化突变会显著影响骨架
这5个失稳性突变，加上上述两个Gly/Pro突变，被认为是回复突变
者，并包含在hu3F8-H3L3的序列中(SEQ ID NO:9和10)。对m3F8
构的计算分析还鉴定了5个对抗体稳定性将具有中性影响的人源化
(数据未显示)。这些突变是轻链的第24和56位，以及重链的第20、58
对m3F8的晶体结构的VH-VL界面进行了分析以在hu3F8中保留各个
这些稳定性增强的框架区是不可能通过涉及使用同源性建模来设计稳
括重链
链中分
柔性。
的候选
晶体结
突变
和92位。这些突变不包括在基于同源性模型的hu3F8-H1L1的序列中(SEQ
ID NO:4和5)，但包括在对hu3F8-H3L3的设计中。
氢键和pi相互作用(表10)。在界面相互作用所牵涉的15个氨基酸中，14个
被保留在hu3F8-H1L1和hu3F8-H3L3的设计中。不包括在内的那个相互作
用涉及轻链中的Ser43。将该突变加入到hu3F8-L1和hu3F8-L3的设计中以
产生Hu3F8-L1S和Hu3F8-L3S。
定的人源化框架的现有技术实现的。具有提高的稳定性概貌的新抗体的设计
需要将实验获得的m3F8晶体结构与使用力场方法的计算分析结合起
用。 来使
表9.对m3F8Fv晶体结构的人源化突变的计算分析
改变骨架柔性的突变.
会使小鼠结构失稳或
T21S G97Q
对稳定性的影响将可忽略的突变
表10.m3F8Fv晶体结构的VH-VL界面处的氨基酸之间的重要相互作用
实施例11 基于对3F8:GD2相互作用的计算分析的3F8抗体的更高亲和力 使用m3F8的晶体结构作为模板进行计算研究来确定抗原识别的分子 GD2抗原由一个五糖(penta-saccharide)头部基团及与之相连的神经酰 尾部组成。在没有实验获得的3F8:GD2共复合物的条件下，尝试仅 GD2五糖头部基团进行计算对接，其中将神经酰胺部分替换成甲基基团。 鉴于计算对接领域的发展水平，GD2五糖分子对于对接研究是一个重大挑 战。首先，大型、柔性配体的对接是难于准确预 过30个可旋转的键。目前尚未报道有确 此高柔性的配体。其次，GD2头 细节。 胺脂质 与
测的。GD2头部基团具有超
立的对接规程可准确地用于具有如
部基团是碳水化合物分子，而关于当对碳水 化合物分子应用力场法时对
团是一类特殊的碳水
酸部分中。尚
且带电
接研究的准确度的报道很少。第三，GD2头部基
化合物，因为它具有两个带电的基团，存在于它的唾液
未有确立的对接方法被显示可准确地预测如此大型、柔性、并
的碳水化合物的结合构象。
一种据报道能够可靠地预测寡糖(尽管不含带电的唾液酸残基)的结合
对接算法是GLIDE(Agostino et al.，2009，J Chem Inf Model49，
构象的
2749-
60)。该报道显示，当预测寡糖对抗体的结合构象并与实验获得的共晶
体结构比较时，GLIDE的性能优于AutoDock、GOLD和FlexX。应当注意
的是，其测试的抗原均不大于四糖。文献中另一种有前景的对接算法是
CDOCKER(Wu et al.，2003， Chem24，1549)，这是一种基于
CHARMm的对接算法，已显示其预测具有8个或更多可旋转键的配体的对
接构象的性能优于DOCK、FlexX、和GOLD(Erickson et al.，2004，
47，45-55)。应当注意，该研究中未分析寡糖，且其测试的配
性比GD2(>30个可旋转键)小得多。
J Med Chem
体的大小和柔
利用可获自蛋白数据库的三个测试实例(PDB编号2HRL:Siglec-7与
的复合物；PDB编号3BWR：猿病毒VP1与GM1的复合物；以及PDB
编号3HMY：破伤风毒素HCR/T与GT2的复合物)对于GLIDE与
GT1b
CDOCKER
to-head)比较。
对接与GD2相似的配体(含唾液酸的寡糖)进行了头对头(head-
在三个测试实例的所有2个中，CDOCKER能够准确地
合模式(均方根偏差2之内)。 预测各寡糖的正确结
GLIDE在3个测试实例的2个中对接不准确(均方根偏差>2)，而在第
接
三个测试实例中未能找到对接姿态(见表11)。由该分析可见CDOCKER对
带电荷寡糖的性能优于GLIDE。
GLIDE在每一个实例中均失败(见表11)。
然后使用CDOCKER来将GD2五糖头部基团对接到m3F8晶体结构的
抗原结合口袋。然后将最优对接的结构(top docked structure)利用CHARMm
力场进行能量最小化。该分析指明了与GD2头部基团直接相互作用的14个
氨基酸(表12)。然后在计算机上将这些位置分别突变成所有可能的氨基酸，
并计算基于CHARMm的相互作用能。相互作用
于这种方法，预测一个突变(重链
建模显示将重链CDR3第54位的
加与GD2配体的接触。使
最高的突变体列于表13。基
Gly54Ile)可显著增加相互作用能。计算机
Gly取代为Ile将改变结合口袋的形状并增
用该分析来将重链突变Gly54Ile添加到
序列的CDR区，分别形成huH1I-gamma1
对接方法
huH1-gamma1和huH3-gamma1的
和huH3I-gamma。
使用Schrodinger Suite2009(New York，NY)来进行GLIDE 对接。使用
根偏差OPLS力场来参数化蛋白质和配体。将最优配体姿势集簇于均方
2.0之内并用GlideScore打分。
使用Discovery Studio3.0(Accelrys，San Diego，CA)进行CDOCKER对
表11.对接算法GLIDE与CDOCKER预测已知蛋白:神经节苷脂复合物的比
较
接和相互作用能测量。使用CHARMm力场来参数化蛋白质和配体。将最优
配体姿势集簇于均方根偏差2.0之内并用CDOCKER Interaction Energy打
分。
实施例12
通过提高对抗原和Fc受体(FcR)的亲和力改善效应物功能
抗GD2MoAb是针对化疗抗性的转移神经母细胞瘤(NB)的经验证的疗
表12.基于CDOCKER与CHARMm能量最小化的与GD2直接相互作用的
表13.3F8中与GD2头部基团相互作用的残基的计算机突变分析所得的最优
CDR突变体 3F8氨基酸残基 法，ch14.18提供了下一代MoAb的标尺。抗GD2MoAb小鼠3F8(m3F8)与 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的组合在80%的原发性顽固性NB 患者中一贯地诱导了完全骨髓缓解。在受治疗的处于最先完全缓解/非常好 的部分缓解(CR/VGPR)中的患者中，该组合加上13-顺-视黄酸改善了5年后 PFS至51%±7%，以及OS至80%±5%。表12.基于CDOCKER与CHARMm 能量最小化的与GD2直接相互作用的3F8氨基酸残基。结果分析一再显示 基于基因多态性的FcR亲和力在NB和其他实体瘤的MoAb疗法中的重要 性。在不牺牲特异性的同时改善对抗原和FcR的亲和力可改善MoAb在体 外和体内的效力。 54
方法：
通过基因工程构建huIgG1亚类的嵌合3F8(ch3F8)和人源化3F8
(hu3F8)，在CHO细胞中表达，并通过蛋白A亲和色谱纯化。在特殊的
MAGE1.5CHO细胞中产生了缺少岩藻糖和N-乙酰葡糖胺的的hu3F8Fc糖
形(hu3F8n或hu3F8-MAGE1.5)。使用BIACORE T-100比较了这些MoAb形
式对GD2以及对FcR的亲和力。利用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性
和补体介导的细胞毒性(CMC)测定法测试了效应物功能，并从
得出了它们的效力。将这些策略应用于具有临床潜力的
统(B7-H3、HER-2、CSPG4、LI CAM)的MoAb。
(ADCC)
MoAb的EC50
针对其他肿瘤抗原系
结果：
Ch3F8和hu3F8维持了与m3F8相似的Kd，它们与14G.2a或chl4.18 相比都
具有慢10倍的koff，从而有更好的KD和更长的驻留时间。M3F8、
ch3F8或hu3F8在体外抑制了NB细胞系的扩增，而其他抗GD2抗体没有效
果。在外周血单个核细胞(PBMC)-ADCC、粒细胞(PMN)-ADCC、或CMC
ch3F8与hu3F8比chl4.18强超过10倍。hu3F8n的PBMC-ADCC比中，
hu3F8 效率高10倍，而比m3F8高>100倍。虽然在生物分布研究中
示与131I-m3F8近似的肿瘤对正常
示了更优越的抗肿瘤作用。尽管就
体可以得到类似的结论，但
而言是关键的。
131I-hu3F8显
组织比，但hu3F8针对NB异种移植物显
针对其他肿瘤抗原系统的嵌合和人源化抗
肿瘤表位/抗原的性质对于确定肿瘤杀死的效率
结论：
虽然对抗原或FcR的koff(或KD)单独地改善了效应物功
能，但对于抗 GD2MoAb3F8而言它们的作用结合起来似乎是相乘性
来旨在改善这两种亲和力的策略可能进一步增加
的临床效力。
的(multiplicative)。将
迄今为止观察到的MoAb
实施例13
进一步Fc修饰以改善FcR结合：
已经制备了在重链中具有三突变DEL(S239D/A330L/I332E)的
DEL(Lazar et al.，2006，PNAS USA103，4005-10)，其具有显
FcR3A和FcR2A的亲和力，以及对FcR2B的亲和力(见表14中
Hu3F8-IgG1-
著增加的对
的
BIACORE数据)。然而，CD16-158V对hu3F8-IgGn的活化信号对抑制信
表14:相对亲和力.通过使用BIACORE T-100使抗体流过CM5芯片
组FcR来确定KD。所有值均对FcRIII-158F上的hu3F8-IgG1结合标
上的重
准化。
号的A/I比为196，相比之下hu3F8-IgG1-DEL则为30，有人提出这具有临
床上的优势(Nimmerjahn and Ravetch，Immunol Rev，236:265-275，2010)。
对神经母细胞瘤LAN-1的CD16介导的ADCC
在历时4小时的51Cr释放测定中，在不同抗体浓度下以效应物:靶物比
对FcR的亲和力的增加导致由CD16或CD32介导的ADCC效力增加。
补体介导的神经母细胞瘤LAN-1裂解
在历时4小时的51Cr释放测定中，在抗体的递增浓度下以1:100的最
终 血清补体稀释度将人补体加入神经母细胞瘤LAN-1肿瘤靶物中。在
导的裂解中(CMC、数据未显示)，hu3F8-IgG1-DEL并不比
hu3F8-IgG1n差。当IgG重链中的三突变与hu3F8-
没有进一步的改善。
对于由CD16介导的ADCC(数据未显示)，hu3F8-IgG1-DEL和hu3F8-IgG1n
是等同的。
5:1将NK92-CD16效应物细胞添加到LAN1神经母细胞瘤肿瘤靶物中。
补体介
hu3F8-IgG1或
IGg1n组合时，对ADCC
实施例15
在体内武装T细胞和效应物
T细胞或称T淋巴细胞是参与细胞介导免疫的关键白细胞。可以基于
它们细胞表面上的称为T细胞受体(TCR)的特殊受体的存在将它们与其他淋
巴细胞类型，如B细胞和天然杀伤(NK)细胞区分开来。它们还携带一种独
特的表面标记物，称为CD3。T代表胸腺，这是主要负责T细胞成熟的器
T细胞存在数种亚群，分别具有不同的功能。T辅助细胞(TH细胞)在
程(包括B细胞成熟以分泌抗体，以及细胞毒性T细胞和巨噬
中帮助其他白细胞。已经将它们称为CD4+T细胞，因为它们
当被活化时，辅助T细胞快速分裂并分泌细胞因子以
这些抗体能够分化为分泌不同的细胞因子的数种
TH17或TFH)以调节免疫应答。在某些
遏癌症生长。尽管常规的活化信号
它们的表面CD3被抗体交联时可
感染的细胞和肿瘤细胞，并
T细胞，因为它们表
性复合物
来接合
官。
免疫过
细胞的活化)
携带CD4蛋白。
调节或帮助免疫应答。
亚型(例如TH1、TH2、TH3、
肿瘤模型中，CD4+T细胞也足以阻
来自抗原呈递细胞(APC)，CD4+T细胞当
以活化。细胞毒性T细胞(CTL)破坏被病毒
且还负责移植物或嫁接物排斥。它们被称为CD8+
达表面CD8糖蛋白。它们通过识别与I类主要组织相容
(MHC)分子(这些分子在许多人类肿瘤上不存在或稀少)缔合的抗原
靶物。记忆T细胞是在病毒或肿瘤细胞被杀死后长期持续存在的抗原
疫
特异性T细胞。当面对肿瘤抗原攻击时它们能够快速大量扩增，从而使免
系统具有针对癌症的“记忆”能力。天然杀伤T细胞(NKT细胞)是一种
T细胞，它们构成获得性免疫系统和天然免疫系统之间的桥梁。
MHC上的肽抗原的常规T细胞，NKT细胞识别被一种称为
递的糖脂抗原。一旦被活化，这些细胞可以行使与Th
功能(即产生细胞因子以及释放溶胞性/杀细胞性
灭肿瘤细胞。γδT细胞(gamma delta T细
其表面上携带TCR。大多数T细
链组成的TCR。然而，在γδT细
它们仅占总T细胞的5%，但在肠
胞，IEL)。活化γδT细胞的
别完整的蛋白，而不是
特殊的
不同于识别
CD1d的分子呈
和Tc细胞二者相似的
分子)。已知它们可识别并消
胞)是T细胞的一个小亚群，它们在
胞具有由称为α和βTCR链的两条糖蛋白
胞中，TCR由一条γ链和一条δ链组成。
粘膜中最为丰富(并且被称为表皮内淋巴细
抗原未知；但γδT细胞不受限于MHC，可能识
MHC上的肽。
在1986年进行的使用淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)和肿瘤浸润性淋
巴细胞(TIL)的获得性免疫治疗试验报道了患者中偶见的肿瘤响应。在同基
因干细胞移植后的慢性髓性白血病患者，或者移植后EBV相关淋巴增殖性
疾病(PTLD)的患者中，供体淋巴细胞输注显示了更多的成功。在实体瘤中，
CTL在高剂量化疗造成的淋巴细胞减少期中治疗恶性黑素瘤获得了
特异性抗体是通过将两种杂交瘤融合产生具有两种结合位点的
蛋白分子而制作的。该抗体不但将肿瘤扭送给T细胞，还交
CD3并引发活化级联。由此，将基于TCR的细胞毒性
靶，而回避MHC限制。通过用抗CD3×抗
克隆活化T细胞(ATC)，将
特异性与T细胞的非MHC
来。BsAb或BiTE可以在
胞。这种策略将每种
成功。双
杂合免疫球
联T细胞上的
重定向到期望的肿瘤
TAA(BsAb或BiTE抗体)武装多
MoAb(例如hu3F8，当TAA为GD2时)的靶向
限制性的穿孔素/颗粒酶介导的细胞毒性结合起
输注到患者体内之前武装经离体扩增的活化T细
ATC转化成特异性的CTL(Thakur and Lum，2010，Curr
Opin Mol Ther12，340-349;Grabert et al.，2006，Clin Cancer Res12，569-
576)。
肿瘤通过多种机制逃避T细胞：低表达或不表达MHC(例如在NB中)，
干扰T细胞信号传导过程，MHC上肿瘤肽的呈递减少，缺失共刺激分子，
以及诱导抑制CTL和体液应答的调节性T细胞。由于经BsAb或BiTE武装
的ATC所实施的杀伤是非MHC限制性的，这种策略应该能够克服这些肿
瘤逃避机制中的某一些。肿瘤分泌TGF-β，使T细胞免疫应答偏向Th2型，
下调白介素2(IL-2)和IFN-γ分泌，同时上调IL-10和IL-6，这都导致
制。通过BsAb或BiTE重定向的T细胞可能回避这些调节性
面作用，因为经武装的ATC是以IL-2非依赖性的方式
经BsAb或BiTE武装的针对其肿瘤的T细胞治
TNF-α和IFN-γ，这应可使T细胞偏向
过它们的Fas配体(FasL)实施杀伤，
免疫抑
细胞因子的负
裂解肿瘤靶物的。用
疗后的患者具有增加水平的
Th1应答。此外，细胞毒性T细胞通
所述Fas配体结合肿瘤细胞上的Fas受 体(CD95)。不幸的是，肿瘤细胞
的TCR刺激可以保护
过交联TCR与BsAb
杀伤(即一个T细胞
淋巴和软组织
捕捉到它们的
上的FasL也可诱导T细胞凋亡。通过CD3
CD8+细胞免于CD95介导的自杀。经武装的ATC通
或BiTE来抵抗CD95诱导的细胞死亡。T细胞的系列
接连杀死多个肿瘤靶物)、在该过程中扩增、以及移动到
中的能力增加了当NB细胞转移出骨髓空间以形成肿瘤团块时
机会。近来使用靶向人癌症的BsAb或BiTE的研究已经显示
了前景。
原来越多的证据，尤其是来自接受了同基因造血细胞移植的患者的分析
即
的证据，支持T细胞阻遏或消灭淋巴瘤以及某些形式的白血病的潜力
(O’reilly et al.，2010，Semin Immunol22，162-172)。然而，尚无有说服力的
证据支持T细胞在控制儿童实体瘤中的作用。这一点与如下的事实一致，
这些肿瘤中的一些不表达遗传的I类或II类HLA等位基因(例如神经
瘤)(Raffaghello et al.，2005，Oncogene24，4634-
Cancer Immunol Immunother54，400-406)，或仅
水平低(例如横纹肌肉瘤)(Prados et al.，2006，
外，关键的共刺激分子如B7.1和ICAM-
这些肿瘤引发T细胞应答的能力
合由HLA等位基因呈递的
前可用的对神经母细
胞肿瘤最有效
可诱导
母细胞
4644;Wolfl et al.，2005，
表达I类等位基因并且表达
Neoplasma53，226-231)。此
1的表达常常低或检测不到。结果，
低下，且效应物T细胞通过T细胞受体结
肿瘤抗原而接合肿瘤的潜力受到限制。此外，目
胞瘤、横纹肌肉瘤、尤因氏肉瘤和促纤维增生性小圆细
的疗法使用免疫抑制性烷化剂，尤其是环磷酰胺，使用的剂量
深度的T细胞减少。双功能抗体允许T细胞的靶向性接合，并允许通
过HLA非限制性CD3介导的活化而非它们的抗原特异性HLA限制性TCR
来利用它们的效应物功能。对某些针对CD3以及一种肿瘤抗原(如CD-19、
HER-2NEU、或CEA)特异性的双功能单克隆抗体的研究已经显示这些抗体
的将细胞毒性T细胞联系到表达该另一种被靶向的抗原的肿瘤细胞的能力
(Bargou et al.，2008，Science321，974-977;Topp et al.，2009，Blood(ASH
Annual Meeting Abstracts)114，840;Kiewe et al.，2006，Clin Cancer Res12，
3085-3091;Lutterbuese et al.，2009，J Immnother32，341-352)。一旦两种抗
体受体均得到接合，则引发针对肿瘤细胞的T细胞应答。T细胞应答涉及T
细胞受体与肿瘤细胞之间的细胞毒性突触的形成，以及穿孔素和颗粒酶介导
的肿瘤细胞凋亡诱导(Offner et al.，2006，Mol Immunol43，763-771;
Brischwein et al.，2006，Mol Immunol43，1129-1143)。CD3的接合也活化T
细胞，诱导扩增和可强化抗肿瘤作用的效应物细胞因子的产生
al.，2006，同上;Brischwein et al.，2007，
注意的是，活化的T细胞上调一种抗凋
在T细胞活化过程中产生的TNF
Int J Cancer100，690-697)。
(Brischwein et
J Immunother30，798-807)。令人
亡蛋白c-FLIP，该蛋白保护它们免受
和Fas配体的细胞毒作用(Dreir et al.，2002，
结果，T细胞应答被放大。结果，皮克水平的双
功能抗体可在体外(Lutterbuese et al.，2009，同上;Brandl et al.，2007，
Immunol Immunother56，1551-1563)和体内发挥显著的抗肿瘤
前动物模型中，尤其是在CD3/CD19双特异性抗体在
ALL的初步临床试验结果(Topp et al.，2009，同
中显示的。已经有假说称所诱导的T细
瘤部位刺激肿瘤特异性T细胞的
1730-1740)。除T淋巴细胞之外，
物细胞。这些效应物细胞包
巨噬细胞、嗜中性粒
达GD2的细
细胞来
抗体、
使用所
Cancer
效果，如临床
治疗B细胞淋巴瘤和
上;Kiewe et al.，2006，同上)
胞应答还可以募集幼稚T细胞并在肿
产生(Koehne et al.，2002，Blood99，
双特异性抗体还可以用来重靶定其他效应
括NK细胞、B-淋巴细胞、树突细胞、单核细胞、
细胞、间充质干细胞、神经干细胞和其他干细胞，到表
胞、组织或器官。当所述组织是肿瘤时，可以利用这些效应物
杀死或者沉积(deposit)用于诊断或用于治疗的蛋白质(例如细胞因子、
酶或毒素)、放射性同位素。当所述组织是正常器官时，可以类似地
述效应物细胞来投递用于诊断或用于治疗的蛋白质或同位素。
双特异性MoAb可以由两个可变域组成，其中一个域具有具有抗3F8
另一个域选自下组：用于重靶定T细胞以实现肿瘤细胞毒性的抗
可变域，
OKT3，
或或用于多步预靶定的DOTA-金属、C8.2.5，或用于以抗41BB-scFv
CD137作为激动剂的ADCC的克隆35、CD137，用于以41BBL作为激
动剂的ADC的41BBL。CH2域中的N297A突变导致无糖基化，结果是没
有FcR或C1q结合。(hu3F8-LC)-(huOKT3-scFv)的氨基酸序列，其中
huOKT3-scFv被二硫化物稳定化，示于SEQ ID NO:23。
(hu3F8-LC)-(C8.2.5-scFv)的氨基酸序列(基于Orcutt et al.，2010，
Design and Selection23，221)，其中C8.2.5-scFv被二硫化物稳
SEQ ID NO:24。
Protein Eng
定化，示于
双特异性抗体(抗GD2和抗DOTA)可以用在多步预靶定中的第一步，
DOTA(金属)-DNA、DOTA(金属)-RNA、和DOTA(金属)-毒素。由于
对每种DOTA-金属复合物(comples)具有不同的亲和力，经预靶定的
对清除剂和DOTA-配体的亲和力可以得到精确的控制。
3F8、hu3F8及其变体的氨基酸序列可以用来构建嵌合抗原受体(CAR)，
C8.2.5
C8.2.5
然后使用DOTA(金属)-右旋糖酐作为清除剂进行血液清除，第三步导入
DOTA(金属)-缀合的治疗剂诸如DOTA(金属)-放射性金属、DOTA(金属)-纳
米颗粒、DOTA(金属-脂质体、DOTA(金属)-药物、
如先前对其他抗GD2抗体显示的那样(Krause et al.，
619-626)。重靶定免疫效应物细胞的CAR策略
用，并容许细胞与许多种细胞表面抗原反
1998，J Exp Med188，
不依赖MHC-肽-TCR相互作
应(Davies and Maher，2010，
克
Achivum immunologiae et therapiae experimentalis58，165-178)。有数种方法
已经被用于CAR的设计中，它们大多采用呈单链可变片段(scFv)形式的单
隆抗体抗原结合域来进行抗原识别。最先的T细胞活化受体源于使
得研究者 探明CD3ζ链的作用的研究(Irving and Weiss，1991，Cell64，
et al.，1992，Cell68，889-897)。在后来的研究中，感
CD3ζ链(Eshhar et al.，1993，PNAS USA90，
et al.，1996，J Immunol157，836-843)，
这制定了CAR构建的蓝图，但共
仅能诱导不超过2-3次细胞
才出现的(Gong et al.，
达CD80，研究者们
胞数目的进一步增加。
CAR与仅表达CD3ζ
Haynes et al.，2002，
20，70-75)；
若干其
与及
2007，
891-901;Romeo
兴趣的scFv被融合于
720-724)或FcεRIγ链(Weijtens
发现二者均足以活化T细胞。虽然
刺激因子的组入是在人们发现第一代CAR
分裂的T细胞扩增，然后很快发生细胞凋亡之后
1999，Neoplasia1，123-127)。通过在靶肿瘤细胞上表
能够显示表达CAR的细胞可以被重新刺激，导致T细
最早的在CD3ζ链之外还组入了CD28共刺激分子的
链者相比显示了巨大的改善(Krause et al.，1998，同上;
Blood100，3155-3163;Maher et al.，2002，Nature Biotech
这包括T细胞数目的绝对增加以及IL-2产生的增加。从那以后，
他研究组开始使用其他的共刺激分子，或是单独与组合，或是
CD28二者组合。这些其他的信号分子包括4-1BB(Wang et al.，
Human Gene Ther18，712-725;Brentjens et al.，2007，Clin Cncer Res13，
5426-5432;Imai et al.，2004，Leukemia18，676-684;Finney et al.，2004，J
Immunol172，104-113)，DAP10(Brentjens et al.，2007，同上)，
et al.，2007，同上;Finney et al.，2004，同
180，4901-4909;Nguyen and Geiger，2003，
al.，2005，Mol Ther12，933-941)和
已经应用于T细胞以及NK细胞的
radiology15，4-
62-
OX40(Brentjens
上;Wilkie et al.，2008，J Immunol
Gene Therapy10，594-604;Pule et
ICOS(Finney et al.,2004，同上)，并且
背景(Daldrup-Link et al.，2005，Eropean
13;Imai and Campana，2004，J Biol Reg Homeostatic Ag18，
71;Roberts et al.，1998，J Immunol375-384;Kruschinski et al.，2008，PNAS
USA105，17481-17486;Pegram et al.，2008，J Immunol181，3449-3455)。
虽然第一代CAR是迄今为止仅有的得到临床测试者，但体外和体内比较均
已显示第二代和第三代CAR具有明显的优势
(Haynes et al.，2002，同上;
Human Gene Ther15，699-708;
Brentjens et al.，2007，同上;Teng et al.，2004，
Haynes et al.，2002，J Immunol169，
Res66，10995-11004;Loskog et al.，
et al.，2004，
3890-
5780-5786;Kowolik et al.，2006，Cancer
2006，Leukemia20，1819-1928;Moeller
Cancer Gene Therapy11，371-379;Vera et al.，2006，Blood108，
3897)。
目前，大多数研究者使用总(bulk)人外周血T细胞，但其他人近来开始
使用EBV-特异性T细胞(Rossig et al.，2002，Blood99，2009-2016)，淋巴
样祖细胞(Zakrzewski et al.，2006，Nature Med12，1039-1047;Zakrzewski et
al.，2008，Nature Biotech26，453-461)，以及未分级的骨髓细胞(Papapetrou
et al.，2009，J clin Invest119，157-168;Wang et al.，1998，Nature Med4，
168-172)。具有溶胞性的，容易培养的杀伤性白血病细胞系(Killer leukemia
cell lines)(例如NK92，NK92MI，KHYG-1)也可为临床前和临床测试提供持
续的CAR表达性效应物细胞的供应源。NK92MI是一种衍生自何杰金氏淋
巴瘤的，并经人IL-2cDNA转导的人NK细胞系；先前的研究已经显示其在
小鼠模型中的强细胞毒能力(Tam et al.，1999，J Hematol8，281-
and Sun，2001，Inter J Cancer93，269-274)。此外，NK92细
床环境，并且经过若干在肾细胞癌和黑素瘤患者中进行
安全的(Arai et al.，2008，Cytotherapy10，625-632)。由
维持且倍增时间相对较短，对于各种测试多种靶
它们是理想的效应物。使用原初的IL-2
鼠和人中显示了最小的毒性，但
致白血病潜力。研究者中尝
产生的一种方法是在接种前
这足以防止NK92MI细胞
安全机制涉及自杀基
因，该基因是
290;Korbelik
胞也已用于临
的I期研究后证明是
于这些细胞易于体外
定途径的细胞毒测定法而言
依赖性NK92细胞系进行的实验在小
IL-2转导的NK92MI细胞可能具有更大的
试在使用NK92细胞的SCID小鼠中避免白血病
使用3000cGy照射效应物。在I期临床试验中，
在免疫受损的患者体内不受控地增殖。一种替代的
因的使用。一个常见的例子是使用疱疹病毒胸苷激酶基
这样工作的：通过施用阿昔洛韦或更昔洛韦，该基因杀死表达
的细胞(Helene et al.，1997，J Immunol5079-5082)。
该基因
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