2024年2月10日发(作者：)

热带作物学报2021,

42(1):

017-024

Chinese

Journal

of

Tropical

Crops芒果MiFRIl和MiFRI2基因的克隆与表达分析黄方，罗

聪*,余海霞，范志毅，谢小杰，刘

源，莫

啸，何新华杯广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530004摘

要：FRIGIDA(FRI)是植物春化途径中影响成花的关键基因之一。本研究克隆了

2个芒果F7"基因，分别命名为

MiFRH和MiFRI2。序列生物信息学分析结果显示，MiFR刀和MZFR72基因的ORF长度分别为1752、1815

bp,编码

584、605个氨基酸，蛋白质分子量为64.98、66.86

kDa„进化树分析结果显示，MiFRIl和MiFRI2分别属于FRIGIDA

和FRIGIDA-like两个分支。表达模式分析结果显示，MiFRIl和MiFRI2基因在芒果的叶、茎和芽(花)中均表达。MiFRIl在芒果的营养期和成花转变期之间的各个组织中表达水平均较低，而在花芽分化后期的叶片和芽中表达水平显

著升高且达到顶峰。的表达高峰在不同组织中出现的时间不同。2个M迟换基因在营养芽转向花芽发育的过程

中的顶芽中表达水平均下降，但在花芽分化后期的顶芽中表达水平又再次上升，而在叶片中2个基因的表达高峰均出

现在花芽分化后期，但MiFRW的表达水平高于M7FAZ2。说明MiFRfc与芒果的花发育有关，但2个基因发挥功能的程

度可能存在差异。关键词：芒果；FRIGIDA;克隆；生物信息学；表达模式中图分类号：S813.3

文献标识码：ACloning

and

Expression

Analysis

of

MiFRIl

and

MiFRI2

Genes

in

MangoHUANG

Fang,

LUO

Cong*,

YU

Haixia,

FAN

Zhiyi,

XIE

Xiaojie,

LIU

Yuan,

MO

Xiao,

HE

Xinhua**College

of

Agriculture,

Guangxi

University

/

State

Key Laboratory

for

Conservation

and

Utilization

of

Subtropical

Agro-bioresour­ces,

Nanning,

Guangxi

530004,

ChinaAbstract:

FRIGIDA

(FRI)

is

one

of

the

key

genes

which

influence

flower

formation

in

plant

in

response

to

vernalization

pathway.

In

this

study,

two

FRI

genes

named

MiFRIl

and

MiFRI2

were

cloned

in

mango.

Sequence

analysis

showed

that

the

open

reading

frame

of

MiFRIl

and

MiFRI2

genes

was

1752

bp

and

1815

bp

in

length,

encoding

584

and

605

amino

acids

with

molecular

weight

64.98

kDa

and

66.86

kDa,

respectively.

Phylogenetic

tree

analysis

showed that

Mi­FRIl

and

MiFRI2

belonged

to

FRIGIDA

and

FRIGIDA-like

family,

respectively.

Expression

analysis

showed

that

Mi­FRIl

and

MiFRI2

expressed

in

leaves,

stems

and

buds/flowers.

The

expression

level

of

MiFRIl was

low

in

all

tested

tissues

between

vegetative

stage

and

flowering

transition

stage,

while

MiFRIl

increased

transcriptional

level

to

the

peak

in

leaves

and

buds

at

the

later

stage

of

bud

differentiation.

The

expression

peak

of

MiFRI2

varied

among

different

tis­sues.

The

expression

level

of

both

MiFRIs

genes

decreased

in

the

terminal

bud

during

the

vegetative

bud

transition

to

flower

bud,

but

increased

again

in the

bud

at the

later

stage

of

flower

bud

differentiation.

The

peak

of

MiFRIs

both

oc­curred

in

leaves

at

the

late

stage

of

flower

bud

differentiation,

but

the

transcriptional

level

of

MiFRIl

was

higher

than

that

of

MIFRI2.

It

indicates

that

MiFRIs

may

play

important

roles

to the

flower

development

in

ds:

mango;

FRIGIDA;

cloning;

bioinfbrmatics;

expression

analysisDOI:

10.3969/.l000-2561.2021.01.003收稿日期

2020-03-19;修回日期

2020-04-08基金项目

国家自然科学基金项目(No.

31860541

)；广西创新驱动发展专项资金项目(No.

AA17204026-2

)；国家现代农业产业

技术体系广西芒果创新团队栽培岗位项目(No.

nycytxgxcxtd-06-02

)0作者简介

黄

方(1994一)，女，硕士研究生，研究方向：果树遗传育种与生物技术。*同等贡献作者：罗

聪(1982—)，男，

博士，副教授，研究方向：果树遗传育种与生物技术。**通讯信者(Corresponding

author

)：何新华(HE Xinhua

),

E-mail:

*******************。

18热带作物学报第42卷开花是植物由营养生长向生殖生长的转变过

程，是植物个体发育和繁殖的关键环节，适时开

花对植物的繁殖成功至关重要［1］,故关于开花的

课题属于热点研究。与草本植物相比，木本果树

通常具有较长的童期，严重制约木本果树新品种

的选育，直接影响经济效益。因此，对木本果树

成花分子机制开展研究具有重要的意义⑵。植物成花过程受内部遗传因子和外界环境因

素的协同诱导［叫

涉及复杂的基因调控网络途径

主要包括：光周期途径、春化途径、赤霉素途径、

自主途径、温敏途径和年龄途径［必］。许多植物需

要一段时间的低温春化作用才能开花［句，

FRIGIDA

（FRI）和

FLOWERING

LOCUS

C（

FLC）

是拟南芥春化途径中的关键调控基因，砲通过

促进FLC的表达延迟植物的开花时间⑺。自然条

件下拟南芥开花时间的多样性可归因于如显性

基因的等位变异，冬性生态型拟南芥通常具有

砲显性基因，能促进开花抑制基因FLC的高表

达，造成晚花表型同，而丧失功能（即显性基因

等位突变）的使FZC表达量降低，则出现早

花表型［9］0Risk等［训发现拟南芥中至少有7个砲

同源基因构成FRIGIDA基因家族。目前对FRI

基因的研究主要集中在模式植物拟南芥和一些依

赖春化作用来促进成花的植物上，木本植物也只

在雷竹⑴］、枳凹和银杏问中有报道。芒果（Mangifera

indica

L.）是漆树科芒果属

的多年生木本植物，是重要的热带亚热带经济果

树。芒果实生苗需要经历较长的童期才能开花结

果，严重制约了芒果新品种的选育进程。目前在芒

果成花研究中已有一些成花基因的研究报道［⑷，

但还尚未有阳基因的报道。本研究在前期研究

的基础上，以'四季蜜芒'为材料，对通过RT-PCR

法获得的2个MiF刃基因序列进行生物信息学分

析，采用实时荧光定量PCR分析这2个基因在不

同组织不同时期的表达模式，为深入研究该基因

的功能奠定基础。1材料与方法1.1材料本研究以’四季蜜芒’（Mangifera

indica

L

cv.

lSijimiO为供试材料，栽培于广西大学农学院教

学科研基地果树标本园。基因克隆样品叶片采集

于2018年11月5日；组织器官和不同发育时期

样本分别采集于2018年11月5日、2018年12

月5日、2019年1月4日、2019年1月29日的

叶、茎、芽以及2019年3月6日的叶、茎、花。

样品采集后立即放入-80

°C冰箱冻存备用。1.2方法1.2.1

总RNA的提取及cDNA合成

使用RNA

perp

Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取

样品总RNA,琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计

检测RNA的完整性和浓度。采用宝生物工程（大

连）有限公司的M-MLV逆转录酶cDNA第一链

合成，反应体系与程序参照试剂盒说明书进行，

琼脂糖凝胶电泳检测逆转录效果。逆转录合成的

cDNA用于后续基因克隆和表达模式分析。1.2.2

芒果MiFRIl和MiFRI2基因的克隆

根据

前期芒果转录组获得的2个阳基因全长序列，

设计扩增基因编码区的特异引物FRI1-F/R和

FRI2-F/R （表1

）,以'四季蜜芒'叶片的cDNA

为模板，进行RT-PCR扩增。PCR反应体系为：10

mmol/L

dNTPs 0.5

|1L、lOxPCR

buffer

2.5

|1L、

10

jimol

的上下游引物各

1

yL、Trans

Taq

0.15

yL、

cDNA模板1

pL、补超纯水至25

gLo

PCR扩增

程序为：95

°C预变性

3

min；

95

°C

40

s,

54

°C

40

s,

72

°C

2

min,

35

个循环；72

°C延伸

10

mino

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回

收，连接到pMD18-T载体上，构建重组质粒，转

化E

coli

DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆送生

工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.2.3

生物信息学分析

运用BioXM

2.6软件对

获得的基因核昔酸序列进行氨基酸序列推测；用

在线软件

ExPASy-ProtParam

（

.

org/protparam/

）分析蛋白分子质量；利用

Conserved

Domain

Search

（

.

/Structure/cdd/）预测蛋白的保守

结构域；在NCBI下载FRI氨基酸同源序列，使

用DNAMAN

5.2.2软件进行序列比对和同源性分

析，用MEGA

6.0软件构建系统发育树。1.2.4

芒果M迥也和基因表达特性分析

以芒果MiActinl为内参基因问，根据基因序列设

计荧光定量引物（表1

）,分别提取芒果不同部位

的总RNA,采用宝生物工程（大连）有限公司的

M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链，实时荧光

定量PCR所用仪器为ABI

7500

Real

Time

PCR仪（Applied

Biosystems,美国加利福尼亚），反应体

第1期黄

方等：芒果MiFRIl和MiFRI2基因的克隆与表达分析19表1引物序列信息Tab.

1

Sequences

information

of

primers引物名称引物序列(5V)退火温度用途Primer

nameFRI1-FPrimer

sequences

(5'-3')ATGGAGCAACAAAACGCGCCTTATTGACATCGATTGATGCTGGATGGCGACACTTGAAACAATAnnealing

temperature/°C54ApplicationMiFRIl克隆FRI1-RFRI2-FFRI2-RqFRIl-FCTACTGAGGGTAGTAAGATGG55606060MiFRI2克隆MiFRIl

qRT-PCRATGGAATGCATGTTGAAGCAAAGAAGCTTGGCAGGATCAAqFRIl-RqFRI2-FqFRI2-RqActinl-FGGAAGCCACAAAAGATTGGAATACGACCTGCTGGGTGAACCCGAGACATGAAGGAGAAGCGTGGTCTCATGGATACCAGCAMiFRI2

qRT-PCRqActinl-RqRT-PCR内参基因M

A

B系和程序参照SYBR®

Premix

Ex

Taq

II试剂

（TaKaRa,中国大连）说明书。具体如下：以

50

gg/L的cDNA为模板，反应体系（20吐）：

SYBRII

IOjliL,

ROXII

0.4

jliL,

cDNA2

pL,上

下游引物各0.5

yL,超纯水6.6

gLo反应程序为：

95

°C预变性

30

s；

95

°C变性

5

s,

60

°C退火

34

s,

40个循环；循环结束后95

°C

15

s,

60

°C

1

min,

95

°C 15

s进行熔解。每个样品重复3次，采用

2_AACt法［⑹计算基因的相对表达量。使用SPSS

22.0软件对数据进行差异显著性分析（PV0.01

）,

用Excel

2016绘制表达图。M:

DL2000

Marker;

A:

MiFRIl;

B:

MiFRI2.图1芒果M还7?九基因的PCP产物Fig.

1

PCR

amplified

products

of MiFRIs

in

mango2结果与分析和MiFRI2基因的核昔酸和氨基酸同源性分别为

39.89%和19.22%,同源性较低。芒果MiFRI

1与

柑橘

CcFRI

（

XP_006437019.2

）、甜橙

CsFRI（XP_006485045.1 ）、龙眼

D1FRI

（

AIN75611.1

）

编码氨基酸的同源性分别为56.65%、56.65%和

2.1芒果MiFRIs基因的克隆与序列分析在前期芒果转录组研究中获得2个FRI同源

基因，分别命名为MiFRH和为了验证

基因序列的正确性，以’四季蜜芒’叶片cDNA

为模板，用特异性引物FRI1F/R和FRI2F/R对其

53.23%

,

MiFRI2

与阿月浑子

PvFRL

1

（

XP_

031253371.1

）同源性为

74.00%o 使用

DNAMAN

5.2.2将2个MiFRIs的氨基酸序列与上述物种氨

编码区全长序列进行RT-PCR扩增。琼脂糖凝胶

电泳检测分别得到长度约1700〜1800

bp大小的特

基酸序列进行多序列比对，结果显示，FRI氨基

异条带（图1

）,克隆测序获得序列与转录组获得

序列一致。MiFRIl基因（GenBank登录号：

酸序列整体保守性较低，但MiFRIl、CsFRI、CcFRI

和D1FRI之间保守性较高，MiFRI2与PvFRLl彼

MT239367

）编码区序列长度为1752

bp,

MiFRI2

基因（GenBank登录号：MT239368

）编码区序列

此间也很保守（图4）,说明同一类型基因在不同

物种间具有保守性，推测MiFRIl和M1FRI2可能

长度为1815

bp,分别编码584、605个氨基酸（图

2）,蛋白质分子质量分别为64.98、66.86

kDao

属于不同类型的FRI家族。从NCBI数据库下载不同物种FRIGIDA和

FRIGIDA-like（

FRL

）的氨基酸序列，用

MEGA

6.0

2.2芒果MiFRIs同源性及进化树分析通过

NCBI・Conserved

Domain

Search

预测到

构建系统进化树，结果见图5O整个进化树被分

2个MiFRIs都含有Frigida结构域,属于FRIGIDA

为五类I、II、III、IV和V,芒果MiFRIl与拟

南芥AtFRI、阿月浑子PvFRI、榴莲DzFRI、可可基因家族（图3

）。经同源性分析结果显示,儿伍朋门

20热带作物学报第42卷A^GAGCAACAAAACGCGCCTGTATTTCTGAAATCCATCAACGAACTGAGCAGCCTGGGCGCTGCCGTACAAGTCTTCGAGCGCCGATTC^KGACACTTGAAACAATTGCAGCTGCCATTAAACAAATACCCTCTAAAAAAGAAGATCTTAAAAAGGCCTTCGATGAACTCCAATCACAAGAGmCAAAACCA£CTCACCGTCACACCAAAACGCGGATCACTCTTTTCTTCTGTCTTCTTTCTCCCTCTCCTGGrcCAATrTAGATGCCCACTTCACCCAAATAGAGAACTCCATTACTCAACGATTCCMmCAACCGCTTACGGAAMGATGCCGCTTCAACCTCAACCTCAGAGTCTACCACCAACTGAAACTCAAACCCTAACCGAAATGGCGCGTCTrCTCGAATCGCTCGAGTCCACTCAGTCTCAGCCGGTTCAGCAACCCCAATTAGATTrACCGTCTCTGTCTCCGTCATTGGCGCCAACTAAGAATGTCAATCTGACTCAAGGGTCTCGGCCTrCTGAGCTTCACrATCTCTGCGAGATGATGTGCAGCOGCGGCCTGAGAAAATACGAGM^CCC^AAfiAAGACCCAGAAGAGGATCXn^GGA^ACACGGAGGMGACCCAfiACGGAGACCCGTCTCCATCTGATCCGGTACTTCTCACGCATCTATCGGACGTTGAAACGCTCCGCCGAGACTCAGCTTCGGCACTAAAATrcGCTCCAAAGCCGGCGAAACTCGTGTrcGCGGAGCCGGCTCAGCGCGAGTTAAATTTATCCACTGTAAAAGACCCATCnCGTCTAACCCACCGAGTGTAGTCCCAGTGGAfiTCAGTAGATTGTGTGCfiACGGTTCnTCTACMGGTAAAAMGCCTACACCMGGACTCTCCCATGATTTCGTCTCCCCAGGCTTCGGTTCTTGTG451TTAACAACiXATreTCOCTCMCCGTAtrAGCCATOTCTrCGAACCCCCCGAGTCAAGACCGAGTrGACTTGGATGTGGCTCTACCCTTGGAGTHTrCCTCAGACTGATTACTGAGAGCGGGGGCCACATrGAGATTGATGAAACGCTTAAACAAGAGGCCGAGAAGGATTCAATTGAGTTGAGAAaxrrATGTGAGAAAATGGACGGTAAAGGGTTAAGAAAATACATAAAOGAGAGTOGAAATGTCCGGSAAAAAGTTCGGGTTGa^AGAAAAAfiACTCXn'TAGTGMGGAGGTTTGAGTAAAGOTGTGAGGnGATGCCAGAGGmACITCTGTTCGTCGCATGTTTrGAGCTCCCMGTG<^TCCGGGTATCTCCGGATCCTGGTrTGATGGTTTTGGATGCAATGGAGGGGTTTTATGGAfiTTGATAACGAfiTrGGGGAHCCTAAAGTTTTTAAAAATGAAGATGTTAGG€ATTTGATTAGGTTCAGTAATATCACGGAGATTAGTGATTTGCTTAAACCGTCTAAAAGTGACMTGACCCAGMTTGTGGGGGACAAGGAGCGCTTGTTreTTGTTAnGGAGGTTTTCTTAGGAATTAATGCAAATATTGGTCGTGmTTrTTGCAAGGGTTCCAGATATCATAGAGAATATGAAAAAGAATGGAATGCATGTTGAAGCAGTTGATATTGTTTACAACTTTGAAGAAGTGAGGGATAGAGCAAAAAGTrrGGCnTrGATTGGAGAAAGAAGTTGAATTrGCATGGAGAAAATG6TTTAGAGrrGTTGGGfiGGGATTGAGGATAAGTTCTCACCTTATACAATTrTGACTTCACTCTTACGGGAGTCTAfiAGAAGCATG

GAAGAGAAAAAGACGAGATGCA901TTCTTGCATrTGGTGGCTGCATATGGGrroGGAAGTGAGTTroAGAAGAATrTTCrTGTGGACTTATCTGTGCCTGCTGCAAAGTACCGGCCGCATCCTCTGAAAAACGCAACTGAAAAGCATrTAGCTGCATTAAAATCTGTTGTCAAGTGTrTGGAAGATCGCAAAATTGATCCTGCCCAAGGTATTGTGTTGAGCAAGGCAATTGATTTAGGAGATAATGITCAAGATCTCATTCAGAAACTTATGGTCAATGGAAAGCAAATTCTG1081AACCnCTTTCTGGATGGCAAATCAAAGAAAACATTGTCAAGTTGGACAAACAAATTGTTGATCTGAATAAACTTATAATGGATGATAAT1081GCTCTGAAATATAnTTrcAGTTTGAGCTGACTGAAAAATACCCACCTGTCCCACTCCTGAAAGCCTATCTGAGCGAGTCCCAGAGGCTT1171AAGMGtrAAAGAGAAAAGCTGGTCAAATrCAGTCATCAAATMTTTCAACTTrCAAGAAACAAAACGTTCTCGATTTACAACCAATGGA1171GCAAAGCAACTTCGCGAGGATGGAAGAAACTCCCTTAGATCACAGAATGAGGCCACAGCCAAAGAAGTTGGTGCCCTGAAAGCAGTGATCQ1261TCAACCCTGGTGTCATCTCCACATGTCATCCGGTTGCATGAACCAATGGCTGCTAACAGTTATATAGATAGGAAGAGATCATATAATACT1261AAAGTAGTTGAAGATTACAAACTTGAATCTGAGTICCCCAAAGACATGCTrcAGAACC&TOTAGAGGTGCTAGAGAAGCrGAAGGCAGAC1351nGATGCCACATCTGITCMTGGTGGmcnXAGCTACATCAGTAATCATCTreCTGCCCCAGCTGCATCGCACGGATATGAAGCAGCA1351AGAAMCGCCCTCCTCCTGCTCCCAAGCCTCAGCAGaGCCTAAGAAGCTACACTGGCAACCAAGGAACCCACAAAAGATTGGAAACAAG1441CCTTTGCCTGAAGCTCTTGGCTCTATAGGACaAGTGGGGGCACTCTGCATGCTATTGGAGTTGAAGTrGGTrTGTCTTCTCGAAGTAGT1441CGTCCTCGAAAAACTGGATCCATTGGCCACACAGCACCAACTGnGTTGCAGCCAATCTAAGTGTTCCCCTATTCCCACAACCCCATTTG1531GT(rrc(m(XACTGCAGGTCCATCTGGTGTTCACAGAGAGGAGTCAAAGGATGCCGTTGGCCAAATGATGTGTGGCAGTGTrTCATCA1531CAGCCAGCAGGTTrATTACCTGAGAATTCTGCTCCATATTTGGQCACACCAGCTGGGCCTTACGGCTTGGTGGGCTCCACTCCTGTAGTT1621AATTATGCGTGGCAfiAGTGTTGCGGTTGCAGCTTATAATGACAGGGTAATTGCSCAACCTGCAGCCAAGQGGGTTGATGTTnGTATGAG1621GCCCCTTATCCACGTrCACCCAGCACGTCGTATCCTTrcACAGGAGCCCAGGTGGGTTTCCCTGGGACCTCAGATCTTGCTGCCTCACAT1711NYGWQSVGVAAYNDRCCGCCATCATATTTCCCAGGTCCCACCATCAATCGATGTCA/^1711mTATTCTTCAGAGTCACAGATGCCTTCTGCGTATOTGATtmCAACTACTTATGGTGGATATAGTTrCCaCCTCAATACCATCCA1801TCTTACTACCCTCA

弼图2芒果MiFRIl

(

A

)和MiFRI2

(

B

)核昔酸序列及其编码氨基酸序列Fig.

2

Nucleotide

and

deduced

amino

acid

sequences

Qi

MiFRIl

(A)

and

MiFRI2

(B)

in

mangoAQuery

ic

hitsSuperfanilies284superfhmilyB

Query

seq.

■Specific

hitsSuperfanilies图3

MiFRIl

(

A

)和M1FRI2

(

B

)氨基酸保守结构域分析1100

200300

400

500605Fig.

3

Conserved

domain

analysis

of

MiFRIl

(A)

and

MiFRI2

(B)TcFRI聚在I类，而芒果MiFRI2与拟南芥

MiFRI2在不同时期内的各组织中均表达，但在各

个组织中表达水平存在差异(图6)oAtFRLl/2,阿月浑子

PvFRL,榴莲

DzFRLl/2,

可可TcFRLl/2聚在II类，说明MiFRIl和MiFRI2

属于FRIGIDA家族不同类型的亚族，MiFRIl属

于I类亚族，MiFRI2属于II类亚族。MiFRIl基因从营养期到花芽分化前期之间

的各个组织中表达水平均偏低，而从花芽分化期

开始，其表达水平在叶片和芽中迅速上升。

2.3芒果MiFftTs基因的组织表达特性分析为了探讨MiFRIs基因在芒果成花过程中的

MiFRIl基因的表达最高峰出现花芽分化后期的

叶中，而此时MiFRIl基因在顶芽中也达到表达

高峰，而在花序伸长及开花期的叶片和花中的表

表达特性，利用实时荧光定量PCR技术检测

MiFRU和MiFJU2在'四季蜜芒’不同花发育阶

达水平则有所下降，但依然极显著高于营养时期

相应的组织，但在茎中的表达一宜维持在较低的段不同组织中的表达模式。结果显示，MiFRIl和

第1期黄

方等：芒果MiFRIl和MiFRI2基因的克隆与表达分析21MiFRIl

............................JSEOCNAPWllsi

1|lSSLGAAM^|eRRFCe|cisLeFI

QTAIH

KLRHETSPSH>ffiCLCRLT.

77CcFRI

............................NACLNESELN|SVN|LSGLASKr

LE|NKRYEE|C善CFICEANET.

.

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75CsFRI

............................MCLNESELI1S'W|lSGLASKI

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75D1FRI

............................MQSEEPPFW?LTfI

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70MiFRI2

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106MiFRIlCcFRI

CsFRI

D1FRIMiFRI2

PvFRLlMiFRIl

CcFRI

CsFRID1FRIM1FRI2

PvFRLlMiFRIl

CcFRI

CsFRI

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...

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PV

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.

PL

CRLAKCLREECKhSL

KRLAKKI

BKEOJfiL228233233241332

H3牛

4I43

23492

412IRFSNT

TEI

SEIIIPSNSQAE1；GT；G®SRI

FARVPEIIENVKK1

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PET

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PEI

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.

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5MiFRIl

rRKRSYNTIAPllLNGGYSS'VT

SEAAPMSH^AAPLPEALGST

CPSGGTVHAI

GEVCLSsKsLPST^CPSCVHREESKDMflCNMXBV

538CcFRI

BEPR/®^EEKRS,YGGLTPliFEG(TGG'¥I

&

BPAVSAASHWflX^LPEALGPAVGAGSBVM'VGVEVSNSPB

TTRP.

TGSFKGHSETAVlia|CNMiANG

546CsFRI

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S.

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TTRP.

TGSFNGVHCETAVrJMCNMWNG

546D1FRI

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LP.

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527MiFRI2

PTWA»SVPLFP(TPyUPfc^TPWAPY^GSPSRS'Y/lLTGAQWTPKSELA

...

^SELYSSESC^PSWYTRSTT

588PvFRLl

PAVKB/TVPLFPC^TPTRP^LXOSTPPWYAGSPI

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A

...

SBLYSSESHNPS|^YEeSTA

608MiFRIl

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■….................:............

584CcFRI S&

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MfiSI

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617CsFRI

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GVSlSRSSSSELyGF^EAV

598MiFRI2

^

605PvFRLl

YGC|

625图4

MiFRIs氨基酸序列多重比较Fig.

4

Multiple sequences

alignment

of

MiFRIs991

TcFRLl

Theobroma

cacao

(EOY12147.1)可可19l

TcFRL2

Theobroma

cacao

(XP_007020622.2)可可_________99|l------------DzFRLl

Durio

zibethinus

(XP_022734673.1)榴莲

99____________I-----------DzFRL2

Durio

zibethinus

(XP_022716788.1)榴莲92999833-----------------------------CpFRLl

Carica

papaya

(XP_021906046.1)番木瓜

I----------PvFRLl

Pistacia

vera

(XP_031253371.1)阿月浑子99l--------------■

MiFRI2]---------------------------AtFRLl

Arabidopsis

thaliana

(AT 5G16320.1)拟南芥99l----------------------------AtFRL2

Arabidopsis

thaliana

(AT1G31814.1)拟南芥-------------------------

AtFRL3

Arabidopsis

thaliana

(AT5G48385.1)拟靑养II|---------AtFRI4a

Arabidopsis

thaliana

(AT3G22440.1)拟南芥莎------AtFRL4b

Arabidopsis

thaliana

(AT4G14900.1)拟南芥AtFRL5

Arabidopsis

thaliana

(AT5G27230.1)拟南芥AtFRI

Arabidopsis

thaliana (AAG23414.1)拟南芥

VvFRI

Vitis

vinifera (XP_002283789.1)葡鬲—DzFRI

Durio

zibethinus

(XP_022771353.1)榴莲

99—TcFRI

Theobroma

cacao

(XP_007038203.2)可可

CpFRI

Carica

papaya

(XP_021905508.1)番木瓜99

-----------------.

MiFRIl―I-----------------------PvFRI

Pistacia

vera

(XP_031282843.1)阿月浑子9962I

m

IV

V9982I----------D1FRI

Dimocarpus

longan

(AIN75611.1)龙眼r

CcFRI

Citrus

sinensis

(XP_006485045.1)甜橙99^

CsFRI

Citrus

Clementina

(XP_006437019.2)克莱门柚0.1图5芒果MiFRIs系统进化树分析Fig.

5

Phylogenetic

tree

analysis

of

MiFRIs in

mango

22热带作物学报第42卷*眾衩wI°A°I

1815129

日叶閒茎窟芽/花AIOAOI

.2O6

330•5-2-°

-52-°50

-1

1

aMiFRI2E3叶溜茎

A团芽/花BC

CDEu水平。MiFRIl基因在不同组织中的表达模式存在

差异。在叶片中，M诃血基因表达水平先下降后

上升，表达高峰出现在花芽分化后期，而后稍微

有些下降，这与MiFRIl基因在叶片中的表达模

式类似。在茎中，必诃人/2基因呈现先上升再下降

的表达模式，这与M法7?刀基因相反。在顶芽中，

期到花芽分化前期之间的表达模式与MiFRIl基

因类似，在花芽分化后期MiFRI2基因表达水平

上升，但上升幅度低于MiFM

基因。3讨论FRI基因是植物响应春化途径的关键调节因

子，其表达能促进下游开花抑制基因FLC的表达,

从而抑制植物的成花转变［⑺。表达高则抑制

开花激活因子FT和SOC1基因的表达，表现为晚

花，反之则表现为早花"J最新研究发现FRI在

春化过程中是通过与某些蛋白相互作用形成复合

物参与到FLC染色质上组蛋白甲基化修饰来调控

植物成花［19'20］o因此朋/在植物开花调控过程中

具有重要作用。目前刃"基因已在大豆0］、紫花苜蓿［22】、咖

啡树©】、雷竹［⑴、枳［⑺等物种中被分离克隆，但

尚未见有芒果

如基因的研究报道。本研究在前

期研究的基础上，从芒果转录组中挖掘获得2个

FRI基因，通过RT-PCR技术对其序列的准确性

进行了验证。生物信息学分析结果显示，MiFRIl

和MiFRI2的编码区序列长度分别为1752、

1815

bp,分别编码584、605个氨基酸，编码蛋

0SSOJdxoA9E3EFEFEF2018.11.5

2018.12.5

2019.1.4

2019.1.29营养期成花诱导期花芽分化期花序伸长及开花期

不同发育时期oAgEIoM2018.11.5

2018.12.5

2019.1.4

2019.1.29

2019.3.6营养期成花诱导期花芽分化期花序伸长及开花期

不同发育时期Different

developmental

stagesDifferent

developmental

stages不同大写字母表示差异极显著(PV0.01)。Different

capital

letters

indicate

extremely

significant

difference

(P<0.01).图6

MiF/m

和在'四季蜜芒'中的表达分析Fig.

6

Expression

analysis

of

MiFRIl

and

MiFRI2

genes

in

M.

indica

L.

cv.

'Sijinii'白含有Frigida结构域，属于

朋"?劝

基因家族。

但2个如基因的核昔酸和氨基酸序列的同源性

均很低，进化树分析结果显示，MiFRIl与AtFRI

聚类在一起，属于I类亚族，而M1FRI2与

AtFRLl/2聚类在一起，属于II类亚族，表明二者

由不同祖先进化而来。FRIGIDA家族成员基因在被子植物和裸子植

物中广泛存在，Risk等a】将拟南芥FRIGIDA家

族的7个同源蛋白依据其N■端序列保守性分为

FRI

(

I

)、FRL1/2

(II)、FRL3

(III)、FRL4a/4b

(IV)

基因的表达水平为先下降后上升，从营养

和FRL5

(V)五类亚族，认为I、II类亚族仅在双

子叶植物存在，111、IV类亚族同时存在于单子叶

植物和双子叶植物中，V亚族只在拟南芥和毛果

杨中发现。另外，Michelle等Bl研究证实拟南芥

中的AtFRI和AtFRLl均为成花抑制因子,能够促

进成花抑制基因皿C的表达，在AtFRI缺失时，

AtFRLl具有冗余的功能。而AtFRL2存在于

Landsberg

erecta

(Ler)型拟南芥中，属于无功能

基因［幻，其他亚族的功能还未见报道。根据目前已经报道的一些物种的功能研究显

示，枳中的PtFRI基因属于I亚族，主要在叶和

花中表达较高，异源表达抑制拟南芥开花［⑵。雷

竹是单子叶植物，PvFRL基因属于III亚族，在营

养组织和生殖器官中均有表达，但在花期表达水

平明显下降，超量表达抑制拟南芥成花［⑴。咖啡

CaFRL4基因是IV亚族，主要在叶片中表达

而银杏属于裸子植物，G方朋/基因在雄花中高度

表达，而在叶中表达水平最低［⑶。在其他植物中,

拟南芥中的AtFRI基因在各个组织中的表达水平

第1期黄

方等：芒果MiFRIl和MiFRI2基因的克隆与表达分析23均很低，主要在发育中的种子中表达，而AtFRL2

基因在各个组织中表达水平也很低，但在发育中

的种子和花粉中具有较高的表达水平[训。油菜

.a基因在叶和茎中少量表达，而在花芽

和花中高表达口句。油菜中的基因在种

子中表达水平最高，其次在根、叶、芽中表达，

在茎中最低©I。白菜中的BrFRIa和BrFRIb基因

的表达水平与成花时间早晚不相关，但超量表达

的BrFRIb可延迟转基因拟南芥成花[绚。上述研

究结果表明，不同物种中的F刃基因的表达模式

存在差异，但功能相对保守，均抑制转基因植株

成花。本研究中，MiFRD和MiFHI2在'四季蜜

芒’成花过程中不同时期内的各组织中均有表达，

其中MiFRIl基因主要在花芽分化后期的叶和芽/

花中高度表达；MiFRI2基因主要在营养期的顶芽

和花芽分化后期的叶片中高度表达。这与雷竹中

的PvFRI-L基因花期表达水平下降的模式存在差

异。2个MzFds基因在营养芽转向花芽发育的过

程中的顶芽中表达水平下降，但在花芽分化后期

的芽中表达水平又再次上升，且MiFRIl基因的

上升水平显著高于MiFRI2基因。说明MiFRIs基

因与芒果的成花有关，但2个基因发挥的功能强

弱可能存在差异，有待进一步研究。参考文献[1]

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and

related

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have

a

conserved

central

domain

and

family

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C-terminal

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