2024年4月20日发(作者：)

DNA损伤检验点ATM—chk2通路影响衰老的作用机制分析

目的 分析DNA损伤检验点ATM-chk2通路对影响衰老的作用机制。 方法

选择SD大鼠4个月龄、12个月龄、20个月龄和28个月龄各10只，分别取4

个月龄、12个月龄、20个月龄和28个月龄大鼠的骨髓组织进行ATM-chk2通路

的观察，并对结果进行分析。 结果 4个月龄、12个月龄、20个月龄和28个月

龄SD大鼠的ATM基因表达随着月龄增加，呈逐渐下降趋势，不同月龄大鼠间

比较，差异具有显著性（P < 0.05）；ATM-chk2通路基因蛋白表达呈逐渐上升趋

势，组间比较差异具有显著性（P < 0.05）。 结论 ATM基因表达及ATM-chk2

通路基因蛋白表达水平和大鼠月龄直接相关，年龄越大ATM基因表达日渐降低，

ATM-chk2通路基因蛋白表达呈逐渐上升趋势。

标签： DNA损伤检验点；ATM-chk2通路；衰老

本研究在前期工作基础上观察老年小鼠DNA损伤检验点ATM-chk2通路的

基因表达变化及淫羊藿苷提取液的干预作用，并进一步通过实验观察利用RNA

干扰技术抑制ATM-chk2通路后对细胞衰老的影响及淫羊藿苷的干预作用是否

发生变化。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 实验动物 采用SD大鼠，由复旦大学科学部实验室提供，分别随机选

择4个月龄、12个月龄、20个月龄和28个月龄各10只。4组SD大鼠的体重、

身长、活跃情况均无显著性差异，具有可比性。

1.1.2 所用试剂 ATM，cdc25c，cdc2，cdc25A，c-Abl 均为SANTA 公司提

供，Cdk2为Biolegend公司生产。

1.2方法

分别取4个月龄、12个月龄、20个月龄和28个月龄大鼠的骨髓组织进行

ATM-chk2通路的观察，并对其结果进行分析。

1.2.1 ATM-chk2通路的研究 ①骨髓组织的制备：分别将4组大鼠脱颈椎处

死。并采用75%的乙醇进行消毒，置于方盘内，拨开大鼠的大腿皮肤，分离肌肉，

剪开双侧股骨颈，采用pH值为7.2 的PBS液冲洗，置于已经灭菌的EP管内。

②骨髓细胞涂片：采用SP免疫组化法，显色剂为DAB。一抗浓度为1∶100。

采集取骨髓细胞进行涂片，采用丙酮做固定液，固定15 min。再经二次蒸馏水进

行清洗，采用pH值为7.2的PBS液少量多次缓缓清洗，再经浓度为3%的双氧

水浸泡以阻断内源性过氧化物酶。在采用二次蒸馏水、pH=7.2值的PBS液重复

上次的清洗操作。再采用正常羊血清工作液37℃封闭10 min，滴加一抗，于4℃

冰箱中过夜孵育。第2日滴加二抗，于37℃培养箱中孵育30 min，经PBS溶液

冲洗3次，每次5 min；冲洗后加DAB显色液，再用PBS溶液冲洗3次，每次

5 min；滴加苏木素染色10 s，待流水返蓝，进行常规脱水，透明，干燥，封片。

1.3 观察指标

在显微镜下对阳性细胞进行计数并统计阳性细胞率。于100倍光学显微镜下

观察五个视野中的蛋白阳性表达率，取均值。

1.4 统计学处理

采用SPSS16.0统计学软件进行分析，计量资料采用方差分析，以P＜0.05

为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别大鼠的ATM基因表达情况比较

4个月龄、12个月龄、20个月龄和28个月龄SD大鼠的ATM基因表达随

着月龄增加，呈逐渐下降趋势，不同月龄大鼠间行方差分析，差异具有统计学意

义（P < 0.05）。

2.2 不同组别大鼠的ATM-chk2通路基因蛋白表达情况比较

4个月龄、12个月龄、20个月龄和28个月龄SD大鼠的ATM-chk2通路基

因蛋白呈逐渐上升趋势，组间行方差齐性检验，差异具有显著性（P < 0.05）。

3讨论

衰老，一般是指生命周期中随增龄而发生的、渐进的、受多种因素影响的、

全身复杂的形态结构与生理功能不可逆的退行性变化[2]。世界性的人口老龄化

趋势，使如何延缓衰老、提高老年人生存质量不仅有医学、生物学等方面的意义

[3]，同时也有更为广泛的社会意义。因此延缓衰老、防治脑老化的研究成为目

前老年医学界主要课题之一，正日益引起医学界的广泛重视[4]。衰老是机体经

长期发展，渐进累积而成，其为机体最复杂的生物过程之一[5]。机体衰老时，

其各种组织、系统、不同层次都发生相应的变化，因此从不同层面去研究衰老的

过程，从而揭示衰老的规律具有更为重要的价值[6]。

DNA损伤造成的基因组不稳定性是衰老发生过程中的核心环节[7]。以

ATM-chk2通路为主的DNA损伤检验点是调控DNA损伤修复最为重要的关卡，

与衰老的发生关系密切[8]。我们前期研究从细胞水平、低等动物、哺乳动物三

个层次发现ATM-chk2通路及其基因蛋白表达对衰老存在一定的影响。同时前期

利用基因芯片技术发现老年小鼠DNA损伤反应相关基因表达上调，但ATM基

因表达下调[9]。细胞周期DNA损伤的检测主要依赖于细胞周期监测点信号通路

来完成，其中毛细血管扩张共济失调突变基因（ATM基因）及其编码的产物蛋

白激酶在该通路中起着重要的作用[10，11]。ATM基因通路是DNA修复中十分

重要的调控网络[12]。ATR-chk2通路信号转导路径：DNA损伤诱导ATR激活下

游chk1，chk1主要磷酸化Cdc25C[13]，通过Cdc2调控G2/M期；也介入ATM-chk2

下游通路，磷酸化Cdc25A，参与S期损伤检测调控[14，15]。

本研究资料中，4个月龄、12个月龄、20个月龄和28个月龄SD大鼠的ATM

基因表达随着月龄增加，呈逐渐下降趋势，不同月龄大鼠间比较，差异具有统计

学意义（P < 0.05）；ATM-chk2通路基因表达呈逐渐上升趋势，组间比较差异具

有统计学意义（P < 0.05）。综上所述，ATM基因表达及ATM-chk2通路基因蛋白

表达水平与大鼠月龄直接相关。

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