波长变换高效液相色谱法测定逍遥丸中6种活性成分

2024年6月2日发(作者：)

波长变换高效液相色谱法测定逍遥丸中6种活性成分

赵巍;汪正宇;武志昂

【摘 要】目的 建立同时测定逍遥丸中6种成分(绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏

酸、甘草酸和Z-藁本内酯)的高效液相色谱分析方法.方法 色谱柱为Kromasil C18

柱(250 mm×4.6 mm,5μm);乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱:0～

10 min,5％A;10～25 min,5％A→15％A;20～70 min,15％A→60％A;波长:0～

27.0 min为326 nm(绿原酸),27.0～30.5 min为230 nm(芍药苷),30.5～36.0

min为280 nm(甘草苷、阿魏酸),36.0～52.0 min为276 nm(甘草酸),52.0～70.0

min为350 nm(Z-藁本内酯);体积流量1.0 mL?min-1;柱温35℃;进样量10μL.结

果 绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯分离度良好,质量浓度

分别在27.09～270.90,30.22～302.23,12.45～124.48,9.79～97.92,6.89～

68.92,7.46～74.56μg?mL-1线性关系良好,均r>0.9990,平均加样回收率为

97.9％～100.8％(RSD在0.55％～1.83％).6批样品中绿原酸、芍药苷、甘草苷、

阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯分别在12.25～12.30,10.38～10.45,5.58～

5.64,5.07～5.14,2.01～2.08,2.67～2.74 mg?g-1.结论 本方法专属性好、灵敏度

高、准确度高,为逍遥丸的质量控制提供依据.

【期刊名称】《医药导报》

【年(卷),期】2018(037)008

【总页数】4页(P1000-1003)

【关键词】逍遥丸;绿原酸;芍药苷;甘草苷;阿魏酸;甘草酸;Z-藁本内酯;色谱法,高效液

相;含量测定

【作 者】赵巍;汪正宇;武志昂

【作者单位】沈阳药科大学工商管理学院,沈阳 110016;北京市药品检验所北京市

保健食品化妆品检验中心,北京100035;安徽省宿州市食品药品检验所,宿州

234000;沈阳药科大学工商管理学院,沈阳 110016

【正文语种】中 文

【中图分类】R286;R927.2

逍遥丸(浓缩丸)来源于宋代汉医方剂学著作—《太平惠民和剂局方》，现收载在

《中华人民共和国药典》2015年版一部[1]，临床用于治疗肝郁脾虚所致的脘闷不

舒、胸胁胀痛、头晕目眩、食欲减退和月经不调等疾病，研究表明，该药还对抑郁

征[2]、围绝经期综合征[3]、乳腺增生症[4]、免疫性不孕[5]、Ⅲ型慢性前列腺炎[6]

和慢性疲劳综合征[7]等疾病。逍遥丸是由柴胡、当归、白芍、炒白术、茯苓、炙

甘草和薄荷等七味药材制成的成方制剂，涉及药材种类多，所含成分复杂，比如药

材当归中含有阿魏酸及Z-藁本内酯成分，白芍含有芍药苷及阿魏酸，白术含阿魏

酸以及甘草含有甘草酸和甘草苷成分，当归、白术和茯苓均含有绿原酸；《中华人

民共和国药典》2010年版仅对芍药苷做了定量质控要求，而成英等[8]采用高效液

相色谱(HPLC)法测定逍遥丸中甘草苷、异甘草素和甘草酸的含量。易润青等[9]采

用毛细管电泳法测定逍遥丸中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，苏兰宜等[10]对

逍遥丸中芍药苷、阿魏酸和槲皮素的含量做了研究，白雁等[11]采用近红外光谱法

快速测定逍遥丸中芍药苷的含量。张庆等[12] 采用HPLC法测定加味逍遥丸中芍

药苷的含量。李珂等[13]利用高效液相色谱法测定加味逍遥丸中丹皮酚的含量。上

述研究虽对逍遥丸中一部分成分做了深入研究，然而同时测定6种成分方面的研

究笔者还未见报道。笔者在本研究中建立HPLC波长转换法同时测定逍遥丸中绿

原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸、Z-藁本内酯等6种活性成分的方法，

方法简单、快捷，重复性好，能为系统地评价和控制逍遥丸的质量提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695-2996型高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；BS124S型电

子天平(德国赛多利斯公司，感量：0.01 mg)；DL-360A型超声波清洗器(上海之

信仪器有限公司，功率：240 W)，BGZ-700型鼓风干燥箱(上海博迅医疗生物仪

器股份有限公司)，Arium611UV型实验室超纯水系统(德国赛多利斯公司)。

1.2 试药 芍药苷对照品(批号：110736-201640，纯度：95.2%)、阿魏酸对照品

(批号：110773-201313，纯度：99.6%)、甘草苷对照品(批号：111610-201607，

纯度：93.1%)、绿原酸对照品(批号：110753- 201415，纯度：96.2%)、甘草酸

对照品(批号：110731-201619，纯度：93.0%)均购于中国食品药品检定研究院，

Z-藁本内酯对照品(批号：110825，纯度：>98%)购自上海融禾医药科技有限公

司。逍遥丸，芜湖张恒春药业有限公司，批号分别为1510261，1603251，

1603261，1604221，1605221，1606121。甲醇、乙腈为色谱纯(美国默克公

司)，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸、

Z-藁本内酯对照品各适量，置50 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超声处理30 min

使溶解完全，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备

液5 mL置100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度分别为绿原酸270.90

μg·mL-1、芍药苷302.23 μg·mL-1、甘草苷124.48 μg·mL-1、阿魏酸97.92

μg·mL-1、甘草酸68.92 μg·mL-1和Z-藁本内酯74.56 μg·mL-1的混合对照品溶

液，摇匀，滤过，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品若干，研细，精密称取细粉1.0 g，置200 mL干

燥具塞锥形瓶中，精密量入甲醇100 mL，密塞，精密称定，超声处理(功率240

W)30 min，放冷，再精密称定，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，

即得。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 按“2.1.2”项工艺方法制备缺少当归、白芍、炙甘草、

白术和茯苓的阴性样品，按“2.1.2”项方法制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为

乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)系统，梯度洗脱：0～10 min，5%A；10～25 min，

5%A→15% A；10～70 min，15%A→60%A；测定波长：0～27.0 min为326

nm(绿原酸)，27.0～30.5 min 为230 nm(芍药苷)，30.5～36.0 min为280

nm(甘草苷、阿魏酸)，36.0～52.0 min为276 nm(甘草酸)，52.0～70.0 min为

350 nm(Z-藁本内酯)；流速为1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃，进样量为：10 μL。

2.3 系统适用性实验 分别取阴性样品溶液、混合对照品溶液和供试品溶液，按

“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱图，考察方法系统适用性。结果各峰分离均

大于1.5，对称性好，且阴性样品对各目标峰无干扰，各峰理论板数均大于4 500，

该方法适用性好。见图1。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别取混合对照品溶液1，3，5，7，8，10 mL，置同一个

10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，得一系列混合对照品溶液，按

“2.2”项色谱条件进行分析，记录色谱图。以各成分的浓度(μg·mL-1)为横坐标

(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制各成分标准曲线，并进行线性回归。结果6种成

分的回归方程分别为绿原酸：Y=122.84X+3.45，r=0.999 0，线性范围27.09～

270.90 μg·mL-1；芍药苷：Y=67.89X-16.81，r=0.999 5，线性范围30.22～

302.23 μg·mL-1；甘草苷：Y=264.65X-1.40，r=0.999 5，线性范围12.45～

124.48 μg·mL-1；阿魏酸：Y=324.88X+32.09，r=0.999 2，线性范围9.79～

97.92 μg·mL-1；甘草酸：Y=208.45X+34.43，r=0.999 4，线性范围6.89～

68.92 μg·mL-1；Z-藁本内酯：Y=120.08X+50.06，r=0.999 2，线性范围

7.46～74.56 μg·mL-1。结果表明在线性范围内各组分进样量与响应值间呈良好的

线性关系。

A.阴性样品；B.混合对照品；C.供试品；1.绿原酸；2.芍药苷；3.甘草苷；4.阿魏

酸；5.甘草酸；6.Z-藁本内酯

图1 3种溶液的HPLC图

ve sample； reference substances；；

genic acid；flori；itin；c acid；rhizic

acid；ilideFig.1 HPLC of three kinds of solution

2.4.2 精密度实验 取同一批(批号：1606121)供试品溶液，在“2.2”项色谱条件

下连续进样6次，记录色谱图，计算各组分峰面积RSD值。结果绿原酸、芍药苷、

甘草苷、阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯峰面积的RSD 值分别为0.15%，0.47%，

0.44%，0.48%，0.13%和0.75%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性实验 取同一批(批号：1606121)供试品，按 “2.1.2”项下制备方法，

平行制备6 份，在“2.2”项色谱条件下检测，记录色谱图，按标准曲线法计算各

组分含量。结果绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯的平均

含量分别为：12.33，10.32，5.43，5.10，2.04和2.72 mg·g-1，RSD分别为

0.78%，0.84%，1.38%，0.78%，1.14%和1.29%，表明方法重复性良好。

2.4.4 稳定性实验 取同一批(批号：1606121)供试品溶液，在“2.2”项色谱条件

下，于0，3，6，9，12 h测定，记录色谱图，计算各组分峰面积RSD。结果绿

原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯峰面积的RSD 值分别为

1.45%，1.00%，0.23%，0.99%，0.56%和1.27%，表明供试品溶液在12 h内

稳定。

2.4.5 加样回收率实验 取同一批(批号：1606121)供试品6份，干燥处理，研细，

取细粉0.5 g，分别加入临配制对照品溶液(含绿原酸5.34 mg·mL-1、芍药苷

5.04 mg·mL-1、甘草苷3.41 mg·mL-1、阿魏酸4.80 mg·mL-1、甘草酸2.54

mg·mL-1和Z-藁本内酯2.36 mg·mL-1)1mL，按 “2.1.2”项下方法制备，按

“2.2”项色谱条件分析，记录色谱图，按标准曲线法计算各组分含量。结果各组

分平均加样回收率分别为98.7%，98.8%，100.8%，97.9%，99.8%和99.6%，

RSD分别为1.10%，1.12%，1.83%，0.99%，0.67%和0.87%，表明该方法准

确度高。见表1。

表1 6种成分加样回收率实验结果Tab.1 Results of recovery tests on six

components成分样品量加入量测得量mg回收率/%绿原酸

6.1395.3411.46899.796.1235.3411.43799.516.1105.3411.31797.516.0905.34

11.32898.096.1995.3411.53099.836.1545.3411.37297.72芍药苷

5.2025.0410.13197.805.0995.0410.162100.465.1145.0410.12299.375.2545.0

410.24999.115.1515.0410.05997.385.1725.0410.15098.77甘草苷

2.3013.415.822103.262.2443.415.62899.242.2333.415.745103.002.2883.415.

68799.682.2413.415.64399.772.2353.415.63399.65阿魏酸

2.5474.807.23697.692.4874.807.16197.382.5164.807.18497.252.5184.807.21

697.882.5264.807.31899.832.4894.807.16797.46甘草酸

1.0172.543.54699.571.0422.543.608101.021.0072.543.54499.881.0182.543.5

4299.371.0392.543.579100.001.0212.543.53999.13Z-藁本内酯

1.3512.363.70099.531.3672.363.753101.101.3342.363.66298.641.3312.363.6

7499.281.3322.363.692100.001.3342.363.67299.07

2.5 含量测定 取逍遥丸供试品6批，按“2.1.2”项下方法制备，以“2.2”项色谱

条件进行分析，记录色谱峰峰面积，以标准曲线法计算各组分质量分数。见表2。

表2 6批逍遥丸中6种成分定量测定结果Tab.2 Quantitative determination of

six components in six batches of Xiaoyao pills mg·g-1，n=2批号绿原酸芍药

苷甘草苷阿魏酸甘草酸Z-藁本内酯

151026112.3010.435.635.122.062.72160325112.2810.455.645.142.082.7416

0326112.2510.405.595.092.032.69160422112.2810.385.585.072.012.671605

22112.2710.435.625.122.062.72160612112.2610.415.615.102.042.70

3 讨论

逍遥丸由七味药材制得，含有多种成分，因结构不同各成分检测参数不尽相同，本

研究结合高效液相色谱仪特点，采用变换检测波长的方式实现同时测定6种成分。

通过扫描紫外-可见光谱图可知，绿原酸在326 nm处有最大吸收，芍药苷最大吸

收波长为230 nm，甘草苷及阿魏酸为280 nm，Z-藁本内酯在350 nm处有最大

吸收，而甘草酸在276 nm处吸收值最强，所以波长变换程序设置为：0～27.0

min 为326 nm(检测绿原酸)，27.0～30.5 min 为230 nm(检测芍药苷)，30.5～

36.0 min 为280 nm(检测甘草苷和阿魏酸)，36.0～52.0 min 为276 nm(检测甘

草酸)，52.0～70.0 min 为350 nm(检测Z-藁本内酯)。

实验先后考察3种流动相系统，分别是甲醇-0.1%磷酸盐水溶液系统、乙腈-磷酸

盐0.1%水溶液系统和乙腈-醋酸盐0.2%水溶液系统，发现甘草酸和阿魏酸出峰时

间很接近，两色谱峰完全分离对流动相提出来严格的要求，只有当选择乙腈-磷酸

盐0.1%水溶液作为流动相时，各色谱峰峰形较好，且甘草酸和阿魏酸能分离完全，

分离度大于1.5，故实验流动相得以确定。

本研究建立波长变换HPLC法，能同时测定逍遥丸中绿原酸、芍药苷、甘草苷、

阿魏酸、甘草酸和Z-藁本内酯等6种成分含量，方法专属性强、灵敏度高、重复

性好，能为逍遥丸的质量控制提供参考依据。

参考文献

【相关文献】

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：1356.

[2] 王静怡，石玉珺，查鹏洲，等.逍遥散的药理研究[J].中国医院药学杂志，2002，22(8)：489-

490.

[3] 王文慧，岳利峰，杜茂生，等.加味逍遥丸调节围绝经期情绪障碍的疗效对比评价[J].中华中医药

杂志，2014，29(3)：836-839.

[4] 蔡海莹，张摇威，谢扬.逍遥丸联合三苯氧胺周期性用药治疗乳腺囊性增生病的临床疗效分析[J].

现代医院，2014，14(4)：37-38.

[5] 揭国梅，祝常德.知柏地黄丸联合丹栀逍遥丸治疗免疫性不孕的临床研究[J].中外健康文摘，

2010，7(21)：114-115.

[6] 曾玉霖，王细生，彭乃雄.中西药联合应用治疗Ⅲ型慢性前列腺炎62例的临床观察[J].贵阳中医

学院学报，2010，32(6)：87-88.

[7] 俞壮武.逍遥丸联合针灸推拿治疗慢性疲劳综合征疗效观察[J].新中医，2015，47(12)：217-

219.

[8] 成英，宋九华.HPLC测定逍遥丸中甘草苷、异甘草素和甘草酸的含量[J].中国现代应用药学，

2012，29(02)：163-166.

[9] 易润青，叶秀金，宋粉云.毛细管电泳法测定逍遥丸中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量[J].中药

新药与临床药理，2011，22(5)：554-557.

[10] 苏兰宜，尹小英.反相高效液相色潽法同时检测逍遥丸中芍药苷、阿魏酸和槲皮素的含量[J].中

国医院药学杂志，2011，31(18)：1558-1560.

[11] 白雁，李小庆，雷敬卫.近红外光谱法快速测定逍遥丸(浓缩丸)中芍药苷含量[J].中医学报，

2013，28(180)：709-711.

[12] 张庆，沈美琼.HPLC法测定加味逍遥丸中芍药苷的含量[J].中国药师，2009，12(4)：468-

469.

[13] 李珂，贾宝秀，刘彩红，等.高效液相色谱法测定加味逍遥丸中丹皮酚的含量[J].医药导报，

2010，29(10)：1354-1355.