2024年6月12日发(作者：)
56
中国兽医杂志
2020
年
（
第
56
卷
）
第10
期
Chinese
Journal
of
Veterinao
Medicine
不同佐剂
对大鼠
去势作用的试验
GnRH
李思洁
1>2
，
吕传忠
2
,任东兴
2
,陈
庚
2
,
李建军
s
付旭彬
2
（
1.
天津农学院动物科学与动物医学学院
，
天津
青
300384
；
2.
天津瑞
物技术股份有限公司
，
天津
300308
）
摘要
:
本试验以促性腺激素释放激
素(
GnRH)
抗原与
5
种不同剂型的佐剂配
伍
，
主
动免疫
SD
雄
性大鼠
,
通过检测血清
睾酮
含量
、
抗体水平和睾丸的变化
,
筛选出免疫去
度从首免
2
周后开
始
好
、
性
、
适
宠
物的免疫佐剂
。
试验
，
免疫组抗体滴
(
X0.05
)
，
二免
4
周后抗体滴度达到最高值
，
其中油包水佐剂组平均血清抗体滴度
最
佐剂组
(
X0.05
)
；
，
水
，
水
高
，
其次为水包油包水组;油包水佐剂组和水包油包水佐剂组在第
15
~23
周龄血清睾酮浓度均低于
0.
1
ng/mL
，
显著低于水
佐剂组
、
纳米水溶性佐剂组和
量下降到对照组睾丸的
1/3
%
组织切
少
数的
细胞
％
水佐剂组
睾
降
的
1/6
,
水
水组
睾
萎缩
，
管内仅有
水佐剂组的睾丸组织中曲细精管上皮
少
，
性
，
可为
宠
物
水佐剂
水佐剂矿物
肽去势疫苗的候选
佐剂
％
关键词
:
免疫去势
；
促性腺激素释放激素
；
免疫佐剂
中图分类号
：
S814.
1
；
S852.2
文献标志码
:
A
文章编号
：
0529-
6005
(
2020
)
10
—
0056
—
03
Study
on
the
Effects
of
Active
Immunization
against
GnRH
Vaccine
with
Differect
Adjuvants
on
Rats
LI
Si-jia
1
，
2
，
LYU
Chuan-zhong
2
，
REN
Dong-xing
2
，
CHEN
Geng
2
，
LI
Jian-jun
1
，
FU
Xu-bin
2
(1.
Colleae
of
Anicai
Science
and
Veterinao
Medicine
，
Tianjin
Agricultural
University
，
Tianjin
300384
，
China
；
2.
TCnjin
Ringpu
Bio-technology
Co.
，
Ltd
，
TCnjin
300308
，
China
)
Abstract
:
To
study
the
effective
safe
castration
vaccine
adjuvant
for
pets
，
SD
male
rats
were
respectively
icmunized
with
5
GnRH
vaccines
with
dCferent
adjuvants
，and
then
serum
testosterone
levels
，
antiCody
levels
and
testicular
changes
were
analyzed.
The
re-
&uet&howed
thattheantibodytiteeoetheimmuniged
geoup
wa&&ignieicanteyhigheethan
thatoetheconteoegeoup
(
P
<0.05
)
aetee2
weeks
of
the
first
icmunization
，
and
the
antibody
tier
reached
the
highest
value
after
the
4th
week
of
the
second
immunization.
The
water-in-oil
adjuvant
group
had
the
highest
average
serum
antibody
titer
，
followed
by
the
water-in-oil-in-water
group.
The
serum
tes
tosterone
concenUation
in
the
water-in-oil
adjuvant
group
and
the
water-in-oil-in-water
adjuvant
group
was
lower
than
0.
1
ng/mL
at
the
age
of
15
to
23
weeks
，
which
was
significanUy
lower
than
that
in
the
oil-in-water
adjuvant
group
，
the
nano-water-roluble
adjuvant
group
and
the
aluminum
gel
adjuvant
group
(
P
<0.
05
)
.
The
testicular
weight
of
the
water-in-oil
adjuvant
group
decreased
to
1/6
of
the
control
group
，
and
the
testicular
weight
of
the
water-in-oil-in-water
group
decreased
to
1/3
of
the
control
testis.
The
tissue
sections
showed
that
the
testis
conveluted
tubule
of
the
water-in-oil-in-water
adjuvant
group
was
severely
atrophied
，
and
only
a
few
spermatogo
nia
were
observed
in
the
tube.
Compared
with
the
water-in-oil
adjuvant，
the
water-in-oil-in-water
adjuvant
with
less
mineral
oil
and
higheesaeetywasmoeesuitab
easacandidateadjueantoesyntheticpeptidecasteation
eaccineeoepet.
Key
wordt
:
immune
castration
；
gonadotropin-releasing
hormone
；
icmune
adjuvant
Corresponding
authort
:
LI
JCn-jun
，
:
jianjunli2003@163.
com
；
FU
Xu-bin，
:
feb@
Ongpu.
com
收稿日期
：
2019
—
05
—
27
作者简介:李思洁
（
1994
-
）
，
女
，
硕士生,研究方向为小动物疾
宠物去势目前普遍采用的是外科阉割法
，
容易
强
反应和术后感染
，
也易
并发
病学
，
：
lee.
sj@
foxmail.
com
通讯作者:李建军
，
:
jianjunli2003
@
163
-
com
；
付旭彬
，
E-
maie
:
eib@eingpuBcom
症
[
1
]
%
免
疫去
势是
利
性
（
Gon-
ddotopin-
01
x
520
hoaona
，
GnRH
）
类似物作为抗原
体产生抗体
，
中和机体
自
身
的
Chinese
Journal
of
Veterinary
Medicine
GnRH
,
破坏下丘脑-垂体-性腺轴的正常反馈调节
,
是一种可替代外科手术的阉割方法⑵
%
GnRH
序列在哺乳动物中除豚鼠外完全一样
，
美国野生动物研究中
心
研究证实
，
同种
GnRH
疫苗
均可以使土拨鼠
、
白尾鹿和野猫免疫去势效力维持
3
年以上
3
〕
，
/
instad
等⑷研究也发现
，
大鼠
、
犬和猩
猩
3
个物种用同一种
GnRH
疫苗进行免疫可产生相
同的免疫去势效果％本试验以大鼠为试验动物
，
将
设计的
GnRH
抗原与
5
种不同的佐剂相配伍
，
以血
清睾酮含量和
GnRH
抗体滴度为判断标准
，
以期筛
选出适合宠物用的合成肽免疫去势疫苗佐剂％
1
材料与方法
1.1
试验材料
1.1.1
主要试剂
合成肽去势疫苗抗原
，
由天津瑞
普生物技术股份有限公司合成
，
分子量为
4
085
-
876
；
油包水佐剂
！
Montanida
ISA
61
VG
)
、
水包油包水佐
剂
(
Montanida
ISA
201
VG
)
、
水包油佐剂
(
Montanida
ISA
15A
VG
)
、
纳米水溶性佐剂
！
Montanida
IMS
1313
VG
),
由法国赛彼科公司生产
；
铝胶佐剂
，
由美国
Therma
Fishav
公司生产
；
自制
GnRH
抗体检测
ELISA
试剂盒％
1-1.2
仪器设备
多肽合成仪(型号
PSI200D
)
，
由
美国多肽公司生产;高速剪切分散乳化机
，
由
FLU-
KO
公司生产;酶联免疫检测仪
，
由美国
Bio-RAD
公
司生产
％
1.1.3
实验动物
8
周龄雄性
SD
大鼠
60
只
，
购自
中国人民解放军军事医学科学院实验动物中
心
％
1.24
试验
4
1.
2.
1
疫苗制备
Montanida
ISA
61
VG
：
抗原溶液
=
13
：
7 (
v/v
)
；
Montanide
ISA
201
VG
：
抗原溶液
=
11
：
9
(
v/
v)
；
Montanide
ISA
15A
VG
：
抗原溶液
=7
：
5
(
v/v
)
;
Mon
tanida
IMS
1313
VG
：
抗原溶液
=1
：
1
(
v/v
)
&铝胶佐剂
：
抗原溶液
=3
：
7
(
v/v
)
%
201
VG
、
15A
VG
和
61
VG
的制
备方式为高速剪切乳化
；
1313
VG
和铝胶佐剂的制备方
式为震荡混匀
。
经性状检验
、
无菌检验合格后分装％
1.2.2
动物试验程序
将
60
只
SD
大鼠随机分为
6
组％于
9
周龄首免
，
11
周龄进行二免
，
每次
0.5
mL/
只,免疫方式为背部皮下注射％于首免前眼球
后静脉丛采血
，
从首免开始每隔
2
周采血
1
次
，
直至
第
23
周龄试验结束;分离血清,分装后保存于
-20
C
检%
试验
1
%
1-2.3
血清睾酮浓度检测
采用碘
［
125
I
］
睾酮放射
免疫分析法
,
委托北京北方生物技术研究所有限公
司检测%
中国兽医杂志
2020
年
(
第56
卷
)
第10
期
57
表
1
试验设计
Tabee1"Tesedesngn
免
疫剂量
/mL
大鼠数量
/只
Geoup
Immunizing
Number
of
dose
eats
空白对照组
_
Conteoegeoup
10
A
组:油包水佐剂
Group
A
:
Water-in-oil
adjuvant
0.5
10
B
:
水
水
佐剂
Group
B
:
Water-in-oil-in-water
adjuvant
0.5
10
C
:
水
佐
剂
Group
C
:
Oil-in-Pater
adjuvant
group
0.5
10
D
组:纳米水溶性佐剂组
Geoup
D
:
Nano-watee-soeubeeadiueant
0.5
10
E
:
佐剂
Group
E
:
Aluminum
gel
adjuvant
0.5
10
1-2.4
血清
GnRH
抗体效价检测
采用间接酶联
免疫吸附法进行抗体效价的测定,
TMB
显色
，
终止
反应后读取
'
450
nm
值
％
1.2.5
睾丸的测量
于
23
周龄对大鼠进行安乐
死
，
摘取两侧睾丸并且除去睾丸周围的脂肪及附
睾
，
称重并测量横径和直径％
1.2.6
睾丸
H.
E.
染色石蜡切片
取空白对照组
与水包油包水组大鼠睾丸
，
制作组织切片并镜检％
1.3
数据分析
试验结果以
“
平均值土标准差
”
方
式表示
。
使用软件
SPSS
23.0
对数据进行方差分
析
，
多重比较方法为
LSD
法
％
P<0
-
05
表示数据在
统计学上具有显著差异;
P
<0.01
表示数据在统计
学上具有极显著差异
％
2
结果
2.1
血清睾酮浓度检测
血清睾酮浓度检测
，
不同个体
、
不同时期的血清睾酮浓度波动较大％在
13
-23
周龄试验
血清睾酮浓度
(
P
<0.05
)%
水佐剂
和水
水佐剂
组在
15
~23
周龄血清睾酮浓度均低于
0.
1
ng/mL
,
油
水佐剂
水
水佐剂
的血清睾酮浓度
差异不显著
！
P
>
0.
05
)%
15
~23
周龄时
，
水包油包
水佐剂
水
佐剂
、
纳
水溶性佐剂
和
胶佐剂组比较
，
血清睾酮浓度显著下降!
P
<0.05
)%
水包油佐剂组
、
纳米水溶性佐剂组和铝胶佐剂组在
免疫后血清睾酮浓度有不同程度的下
降
(见中插彩
1
)%
2.2
GnRH
抗体
检测
SD
大
免疫后检测
同时期的血清抗体水
，
试验
抗体滴度
11
周
龄后均显著高于对照组(
P<0.
05
"
，
在
15
周龄达到
58
中国兽医杂志
2020
年
（
第
56
卷
）
第10
期
Chinese
Journal
of
Veterinary
Medicine
最高峰
，之后呈缓慢下降趋势
。
油包水佐剂组平均
血清抗体滴度最高
在
15
~23
周龄抗体滴度显著高
于其他
4
个试验组
P
<
0.
05
其次为水包油包水
组相比
，
试验组睾丸重量极显著下降
（
P
<0.01
）
%
其中油包水佐剂组睾丸萎缩程度最大
，
重量达到空
白对照组的
1/6
左右;其次是水包油包水佐剂组睾
，
（
）
；
佐剂组
抗体滴度在
15
~23
周龄显著高于水包油佐
（
见中插彩版图
2
）%
2.3
免疫去势大鼠睾丸大小和重量与空白对照
剂组
、
纳米水
溶
性佐剂组和铝胶佐剂组
（
P
<0.
05
）
，
丸重量达到空白对照组的
1/3
,
纳米水溶性佐剂组
、
水包油佐剂组和铝胶佐剂组的睾丸萎缩效果较差
,
睾丸重量是空白对照组的
1/2
以上
（
见表
2
）
%
表
2
大
鼠睾丸
的重量与
大
小
Tabee2
Testicular
weight
and
size
of
rats
分组
(
o±s
,
n
-
10
)
重量
/g
Weight
A
Geoup
A
横径
/
mm
T/nsve/e
diameter
直径
/mm
Diameter
0-
33
±0
-
07
d
7
-
20±0.
79
d
13.40
±0.
84
D
B
Geoup
B
C
Geoup
C
D
Geoup
D
E
Geoup
E
0-
76±0.33
C
9
-
30±0.48
C
15.
50
±0
-
53
C
21.30±0.48B
1.07±0-
43
C
13.20
±0.79
B
0-
89
±0.
62
C
9.40
±0.81
C
18.
60
±0.
77
bc
22.60
±0.54
B
1.52±0.31
B
12
-
70±0.65
bc
空白对照组
Conteoegeoup
1.92±0.
40
a
14
-
40±0.
52
a
24.40
±0.52
A
注:同行数据肩标大写字母不同表示差异极显著
(
P
<0.
01
)
，
字母相同表示差异不显著
(
P
>0.
05
)
Note
:
In
the
same
line
,
the
data
with
diffe/nt
uppercase
letter
superscripts
show
very
significant
dime/nce
(P
<
0.
01)
,
the
data
with
the
same
letter
supe/c/pt
show
no
significant
dmferencc
(
P
>
0.
05
)
2.4
睾丸组织学观察组织染色结果如中插彩版
高于水包油
、
纳米水
溶
性和铝胶佐剂组的抗体滴
图
3
所示
，
空白对照组
（
A
、
B
）
大鼠睾丸细胞结构完
整
，
曲细精管内的精原细胞向管腔发育
，
分化明显%
水包油包水佐剂组
（
C
、
D
）
的大鼠睾丸萎缩明显
，
曲
细精管管径萎缩
，
管腔中出现空泡
％
度
血清睾酮浓度结果显示,油包水佐剂组和水包
油包水佐剂组在
15
~23
周龄时血清
睾酮浓
度均降
％
低到
0.1
ng/mL
以下
（
在
免
疫去势试验中
，
一般将
血清
睾酮浓
度
0.1
ngCmL
为
免
疫去
性
的判断标准⑼
）
，
水包油
、
纳米水溶性和铝胶佐剂组
3
讨论
在二次免疫后虽然血清睾酮浓度显著低于空白对
宠物用疫苗对佐剂安全性要求较高
，
刺激性强
的佐剂会引起注射部位皮肤瘙痒
、
红肿
、
疼痛
、
脓肿
等不同程度炎症反应
，
甚至会引起恶性纤维肿
）
，
但免疫有效率最高分别为
70%
、
60%
和
60%
，
大鼠个体间免疫应答反应差异较大
,
照组!
P<0
-
05
从而会导致临床应用中免疫失败率较高％在一些
研究中也发现
，
铝胶佐剂
水包油佐剂需要连续免
瘤
［
7
］
。
因此
，
宠物用灭活疫苗一
般
都采用刺激性弱
的铝胶佐剂％研究发现
，
铝胶作为高纯度的小分子
疫
3
次才能产生较好的免疫去势效果
［
10
］
%
试验
SD
大鼠
睾
丸萎缩程度与血清
睾酮
和抗体的试验结果
、
蛋白抗原佐剂时不能产生足够的抗体应答
［
8
］
，
合成
肽抗原分子量远小于蛋白抗原
，
以铝胶作为佐剂可
能会影响其
免
疫原性
筛
选出一种
免
疫刺激性强
、
安全性高的佐剂已成为宠物合成肽去势疫苗开发
一
%
油包水佐剂免疫去势效果虽然优于其他
4
种佐
剂
，
但大量研究发现
，
油包水佐剂免疫副反应严重,
注射后可引起无菌化脓和肉芽肿
，
并且油潴留于组
，
的关键
%
本试验
GnRH
疫苗血清抗体滴度显示,水包油
包水佐剂组抗体滴度低于油包水佐剂组
，
但是明显
织中无法完全代谢
，
对机体产生长期不良影响
，甚
（
下转第
63
页
）
Chinese
Journal
of
Veterina/
Medicine
[
8
]
闫伟
・
L-
精
氨酸对免疫应激鹅生长性能
、
器官发育及血液生化
中国兽医杂志
2020
年
(
第56
卷
)
第10
期
63
家禽#
2019
#
41
(
23
)
：
31
—
35.
指标的影响
】
D
]
•扬州
：
扬州大学
#
2010.
[
14
]
梁华#朱明雪#孙燕佩#等-四君子汤
、
四物汤的免疫调节作
用研究进展
[
J
] •中医药信息#
2012
#
29
(
3
)
：
136
—
137.
[
9
]
郑肖川•冬
甲
肉鸡免疫应激调控作用研究
[
D
]
•南
京:南京农业大学#
2016.
[
10
]
张文静#雷连成#魏静元
•
植物精油对肉仔鸡血液生化指标
[
15
]
韩春杨#林德贵#刘翠艳#等-四君子汤发酵液的抗肿瘤作用
及其对荷瘤小鼠免疫功能的影响
[
J].
畜牧兽医学报
#
2008
#
39
(
6
)
：
814
—
818.
及淋巴细胞转化率的影响
[
J
]
牛司料博
®
#
2016
#
4
：
1-
4.
[
11
]
宋志学#
，
孙红国#等•红茂粗
免疫应激断奶仔
[
J
]
•动物营
[
16
]
杜红莲#王蕾#邹荥-四君子汤加减对脾肾两虚型慢性肾脏
性能
、血清生化指标和抗氧化能力的
养学报
#
2013
#
25
(
5
)
：
1062T068-
病患者尿蛋白
/
肌酹比值
、
24
h
尿蛋白定量及肾功能指标的
影响
[
J
]
•湖北中医药大学学报#
2019
#
21
(
5
)
：
23
—
27-
[
17
]
蔡杉杉#李建春#关洪全-四君子汤与氟康瞠对深部念珠菌
病作用及其机制研究
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2001
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19
(
5
)
：
451
-
453.
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张金金#王瑞华#张邦#等•
黑水虻幼虫粉对蛋鸡产蛋后期生
性能
、
蛋品质
及血
报#
2020
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32
(
4
)
：
1
—
8-
化指标的
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中兽医学杂志#
2017
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53
(
5
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：
99.
含
AFB1
饲料肉鸡血清生化指标和肝功能的影响
[
J
]
•中国
(
上接第
58
页
)
导
[
7
]
%
此
，
在宠物用疫苗中一般不采
水剂型
。
水
水佐剂是一种双相佐
44
(
5
)
：
266
—
274.
[
5
]
Levy
J
K
#
FFa/
J
A
#
Miller
L
A
#
e.
a$
Long-term
fe/ilith
conUol
in
female
cats
with
GonaCon
#
a
GnRH
immunocontraceptive
[
J
]
.
剂
，
分含量大幅度降低
，
可以诱导长期免疫
答
，
且疫
良好
，
残留低
，
在接种部位
！
的炎症反
[
11
]
%
研究
，
本试验所选用的
水
水佐剂皮下免疫会
部
，
/heVoaenologa
#
2011
#
76
(
8
)
：
1517T525.
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Finstad
C
L#
Wang
C
Y
#
Kowalski
J
#
et
a$
SyntUetie
luteinizing
hormone
releasing
hormone
(
LHRH
)
vaccine
for effective
andre-
gen
depvvation
and
its
application
to
prostate
cancer
immunothera
py
[
J]
.Vaccine
#2004
#22(9-10)
：
1300
—
1313.
但免疫耐受性极好
，
抗体滴度可维持
2
个月
，
效果
水
佐剂
[
12
]
%
本试验也
证
实
，
水
水
佐剂
[
7
]
Aucoutuver
J
#
Deville
S
#
Perret
C
#
ei
a$
Assessment
of
efIcacy
and
safety
of
various
adjuvant
formulations
with
a
total
soluble
ex
肽去势疫苗抗原的免疫
水 、
纳
水
溶
性和
佐剂
，
在免疫
14
周后
水
的宠物
肽
tract
of
TVchme/a
spiralis
[
J
]
.
Parasite
#
2001
#
8
(
2
Suppl
)
:
S126
—
免疫去
率
到
100%
，
可以替代
S132.
佐剂作为
性高
、
去势疫苗的候选佐剂
。
参考文献
：
[
8
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Masson
J
#
/hibaudon
M
#
Belee
L
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e.
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phosphate
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sub
stitute
for
aluminum
adjuvants?
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review
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vaccines
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299-
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高华义
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吕传忠
#
任东兴#等•多肽合成去势疫苗免疫佐剂的筛
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牧
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2018
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12
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：
87
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89-
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Turkstro
J
A
#
Van
der
Staay
F
J
#
Stockhofe-Burvieden
N
#
et
a$
Pharmacological
and
toxicological
assessment
of
a
potenUal
GnRH
vaccine
in
young-adult
male
pigs
[
J
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Vaccine
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2011
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29
(
21
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—
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刘桂琼#吴琰#等
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动物
GnRHW
免疫去势的研究进展
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399
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Yoder
C
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Miller
L
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EEect
of
GonaCon™
vaccine
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black
tailed
praiJe
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response
and
health
eCects
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罗开健
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张光明#叶贺佳
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等
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一种水包油包水型佐剂疫苗及
其制备方法
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P
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中国专利
：
2,
9
#
2013
-04
-15.
cine#
2010
#
29
(
2
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Miller
L
A
#
Johns
B E
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Killian
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Immunocontraception
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white
-
tailed
deer
with
GnRH
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Am
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Reprod
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#
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江兴华-不同剂型新城疫-禽流感二联灭活疫苗免疫
SPF
鸡
后抗体水平对比试验
[
J
]
多
畐建畜牧兽医#
2016
#
38
(
6
)
：
5-
7-
中国兽医杂志广告招商启事
2021
年本刊广告招
商
活动
开始
,
请广
告
本刊编辑部联系广
告
事宜
。
地
址
:
北京市海淀区
路
2
号
、
中国农业大学动物医学院
电话
：
010-
62733040
，
：
vetzzhi@cau
多
due
，
邮编
：
100193
《
中国兽医杂志
》
编辑部
Chinese
Journal
of
Veterinary
Medicine
中国兽医杂志
2020
年
（
第
56
卷
）
第
10
期
《
不同佐剂
GnRH
疫苗对大鼠去势作用的试验
》
图版
（
作者
：
李思洁
，
李建军
，
付旭彬等
，
正文见第
56
〜
58
,
63
页
）
9.00
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8.00
上
坯
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7.00
6.00
5.00
3.00
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请
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A
组
Group
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组
Group
B
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组
Group
C
D
组
Group
D
2.00-
■
E
组
Group
E
品
■空白
对照组
Control
group
图
！
大鼠血清睾酮含量
Fig.
1
The
testosterone
concentration
in
sera
of
rats
注
：
不同小写字母表示组间差异显著
，
！
<
0.05
；
下图同
Note
:
Different
lowercase
letters
mean
significant
difference
among
groups
,!
<0.
05.
The
same
as
below
呂
一
I
M
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H
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»
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■
A
组
Group
A
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B
组
Group
B
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C
组
Group
C
D
组
Group
D
■
E
组
Group
E
■空白
对照组
Control
group
A
:
Control
group
(
10
x
)
；
B
:
Control
group
(
40
x
)
；
C
:
Water-in-oil-in-water
group
(
10
x
)
；
D
:
Water-in-oil-in-water
group
(
40
x
)
Apoqguz
H
H
U
D
g
u
v
图
2
大鼠血清
GnRH
抗体滴度
Fig.
2
The
anti-GnRH
antibody
titers
in
sera
of
rats
图
3
大鼠睾丸组织学观察
(
H.E.
染色
)
Fig.
3
Histological
observation
of
at
1*+*+
(
H.
E.
staining)
A
：
空白对照组
(10
j
)
；
K
：
空白对照组
(
40x
)
；
C
：
水包油包水组
(
10
j
)
；
D
：
水包油包水组
(
40
x
)
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