2023年12月2日发(作者：)

RNA-Seq分析RPKM,FPKM,TPM,软件比对实例解析在RNA-Seq的分析中，对基因或转录本的read counts数目进行标准化（normalization）是一个极其重要的步骤，因为落在一个基因区域内的read counts数目取决于基因长度和测序深度。很容易理解，一个基因越长，测序深度越高，落在其内部的read counts数目就会相对越多。当我们进行基因差异表达的分析时，往往是在多个样本中比较不同基因的表达量，如果不进行数据标准化，比较结果是没有意义的。因此，我们需要标准化的两个关键因素就是基因长度和测序深度，常常用RPKM (Reads Per Kilobase Million), FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 和 TPM (Trans Per Million)作为标准化数值。那么，这三者计算原理是什么，有何区别呢？下面做详细介绍。为了更清楚的展示计算过程，我们用三个样本的4个基因的read counts矩阵做例子（来源于YouTube）。如表1：Sample1Sample2Sample3Gene NameCountsCountsCounts1060151A (2kb)B (4kb)C (1kb)D (10kb)大家可以清楚地看到，样本3的4个基因read counts数目明显多于其他两个样本，说明其测序深度较高，基因B的长度是基因A的两倍，也使得其read counts在三个样本中都高于A。接下来我们要做就是对这个矩阵进行标准化，分别计算RPKM, FPKM和TPM, 请睁大你的眼睛（为了使数值可读性更好，下面的计算中我们用10代表million）。我们先来说说RPKM怎么算。第一步先将测序深度标准化，计算方法很简单，先分别计算出每个样本的总reads数（这里以10为单位），然后将表中数据分别除以总reads数即可，这样就得到了reads per million. 如下表2：Sample1Sample2Sample3Gene NameCountsCountsCountsA (2kb)B (4kb)C (1kb)D (10kb)2.865.711.4302.675.561.7802.835.661.420.09D (10kb)000.09第二步即是基因长度的标准化了。将表2的read per million直接除以基因长度即可，如表3：Sample1Sample2Sample3Gene NameCountsCountsCounts1.431.431.4301.331.391.7801.421.421.420.009A (2kb)B (4kb)C (1kb)D (10kb)到这里，我们即得到了传说中的RPKM。FPKM和RPKM的定义是相同的，唯一的区别是FPKM适用于双端测序文库，而RPKM适用于单端测序文库。FPKM会将配对比对到一个片段（fragment）上的两个reads计算一次，接下来的计算过程跟RPKM一样。下面，终于轮到TPM登场了。虽然同样是标准化测序深度和基因长度，TPM的不同在于它的处理顺序是不同的。即先考虑基因长度，再是测序深度。我们仍以表1的那个例子来说明TPM是计算过程。第一步直接除以基因长度，得到reads per kilobase，如表4：Sample1Sample2Sample3Gene NameCountsCountsCountsA (2kb)B (4kb)C (1kb)D (10kb)555066.25801515150.1第二步标准化测序深度时，总的reads数要用第一步中除过基因长度的数值。即第一样本除以15，第二个样本除以20.25，第三个样本除以45.1 （别忘了我们的单位是10哦）。表5就是你们想要的TPM了。Sample1Sample2Sample3Gene NameCountsCountsCountsA (2kb)B (4kb)3.333.332.963.093.3263.326C (1kb)D (10kb)3.3303.9503.3260.02下面，是考验你们数学功底的时候了，有没有看出来TPM分分钟完虐FPKM/RPKM？其实，只要我们在表3和表5下面多加一行你就能很轻松地看到区别了。RPKMSample1Sample2Sample3Gene NameCountsCountsCountsA (2kb)B (4kb)C (1kb)D (10kb)TotalTPMSample1Sample2Sample3Gene NameCountsCountsCountsA (2kb)B (4kb)C (1kb)D (10kb)Total3.333.333.330102.963.093.950103.3263.3263.3260.02101.431.431.4304.291.331.391.7804.51.421.421.420.0094.25我们看到每个样本的TPM的总和是相同的，这就意味着TPM数值能体现出比对上某个基因的reads的比例，使得该数值可以直接进行样本间的比较。看到这里，相信大家已经完全理解了RNA-Seq数据标准化的流程了。虽然现在有很多计算差异表达的软件是直接支持read counts作为输入，并且自已完成标准化过程，如DESeq2，但作为生信人，知道这些中间量的计算过程还是很有必要的。生信草堂生信草堂浙大生信博士团队倾力打造的一个科研人员学习交流的公众微信平台。我们致力于科研社区服务，分享最前沿的科技进展，提供生信分析方法，解读经典分析案例，公众数据库的挖掘和临床数据统计分析。在此我们欢迎各位的加入！