2023年12月13日发(作者：)

鲤鱼鱼鳞胶原蛋白ASC与PSC的比较

第27卷第8期

20o8年8月

水产

FISHERIES

科学

SCIENCE

V01.27No.8

AUE.20o8

鲤鱼鱼鳞胶原蛋白ASC与PSC的比较

段蕊,张俊杰,今野久仁彦

(1.江苏海洋生物重点实验室,淮海工学院海洋学院,江苏连云港222005;

2.北海道大学水产学部,日本函馆041—8611)

摘要:以鲤鱼鱼鳞为原料,研究了酸法和酶法提取的鱼鳞胶原蛋白ASC和PSC的异同.经过SDS一

凝胶电泳和氨基酸分析可以看出,2种蛋白在分子构型,氨基酸组成等方面的差异并不明显,经过蛋白

酶K有限酶解后的图谱证明了这一点.但从差热分析,以及蛋白质受热的分解变化来看,二者之间在 热稳定性方面存在一定的差异.推测差距产生的原因与蛋白质制备过程中,胃蛋白酶的作用有关,胶

原蛋白两端的非螺旋区域受到酶的作用而分解,非螺旋区域对三螺旋的稳定性起着重要作用,非螺旋

区域的分解大大降低了PSC对热的耐受性.

关键词:鲤鱼;鱼鳞;酸溶性胶原蛋白;酶溶性胶原蛋白

中图分类号:s986文献标识码:A号:1003—1111(2008)08-03974)4

不同类型的胶原蛋白在结构上有很大差别,但

所有的胶原蛋白均具有由3条Ot链组成的右手三

螺旋结构.形成螺旋结构的3条Ot链可以是相同

的,也可以是不同的,每条Ot链自身形成左手螺旋.

三条链依次交错排列,以右手螺旋围绕中心轴线形

成三螺旋结构….

三螺旋区域的氨基酸分别约有200或460个,

非螺旋末端短肽起着与基质中其他蛋白交联以及

在胶原蛋白分子内部共价交联的作用,非螺旋区域

在不同类型结构和功能上的差异较大.自然的三

螺旋具有抵抗如胃蛋白酶,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白

酶的能力,只能被特异的胶原蛋白酶水解.

水产胶原蛋白本身具有与陆生动物不同的性

质,水产胶原蛋白的溶解性较好,存在于真皮,鳔,

文章编肌肉等软组织中的胶原纤维即使在低温下也易溶

于中性盐溶液和稀酸J,较易于形成可溶性胶原蛋

白溶液,此外,由于水产胶原蛋白中脯氨酸和羟脯

氨酸的含量一般较陆生动物低,随生物生存水温的

变化而变化,而且相当敏感,因此在利用较低变性

温度的胶原蛋白时,水产类胶原蛋白有独特的优

势.水产胶原蛋白的安全性更高,化妆品,食品,药

品等应用的胶原蛋白,安全性是特别引起关注的,

由于近年来哺乳动物疫病的爆发和人,畜共患病的

增加,世界各国都在积极的寻找合理利用水产胶原

蛋白的方法.

鱼鳞是一种很好的提取胶原蛋白原料,含有的

杂蛋白和脂肪,血液,肌肉组织少-3J.笔者主要针

对酸法和酶法提取的鱼鳞胶原蛋白之酸溶性胶原

蛋白(ASC)和酶溶性胶原蛋白(PSC)进行研究.

难以溶解的胶原蛋白,通常采用加人蛋白酶的

方法促进胶原蛋白纤维的溶解,在未变性的条件

下,将胶原蛋白暴露在酶中,利用它对胶原蛋白有

限的水解达到提高得率的目的.胃蛋白酶只对胶

原蛋白的非螺旋区域起作用,对螺旋区不进行水

解引.

胃蛋白酶对胶原非螺旋区域水解,增大了胶原 蛋白的溶解度,因此采用胃蛋白酶制备PSC胶原是

目前应用效果较好的方法.

1材料与方法

1.1材料

鱼鳞:新鲜鲤(Cyprinuscarpi,o)鱼鳞充分洗涤并

装于密封袋中,一2O℃冷冻保存.

1.2主要试剂

十二烷基硫酸钠(SDS),丙烯酰胺,甲叉丙烯

酰胺(日本和光株式会社);胃蛋白酶,巯基乙醇,甘

氨酸等(Sigma公司);氢氧化钠,盐酸,乙二胺四乙

酸二钠,冰乙酸,无水乙醇等均为国产分析纯.

1.3试验方法

1.3.1样品预处理方法

将原料鱼鳞在低温下EDTA脱钙,脱钙条件:

0.5mol/LEDTA溶液以1:10的料液于低温下脱

钙3—5h,脱钙完成后用0.15mol/L氯化钠溶液浸

泡过夜,抽滤除去滤液,并用蒸馏水反复清洗鱼鳞,

抽干备用.

1.3.2ASC的提取

收稿日期:2007—11—21;修回日期:2008—01—15.

基金项目:江苏省海洋生物重点建设实验室基金资助项目(2006HS016). 作者简介:段蕊(1972一),女,副教授,博士研究生,研究方向:水产品加工与综合利用;E—mail:*******************.cn

水产科学第27卷

称取鱼鳞,按1.3.1的方法处理后,按1:10

比例加入0.5mol/L乙酸溶液作为提取剂[5-6j,4℃

提取3d,然后低温过滤,离心取上清液得ASC溶

液,沉淀用以提取PSC.

1.3.3PSC的提取

鱼鳞经过1.3.2的方法处理后,在离心后的沉

淀中以1:10比例加入0.5mol/L乙酸和1%胃蛋

白酶[鱼鳞质量(干)]进行提取,在4℃下溶出72

h后,离心取上清液得PSC溶液.

1.3.4胶原蛋白的纯化方法

ASC和PSC溶液中加入0.05mol/LTris和2.5

mol/L氯化钠,冰箱4℃静置过夜,4000r/min离心

30min,得到盐析后的ASC和PSC沉淀,再将沉淀

重新溶解在0.5mol/L的醋酸中,5℃,对0.01

mol/L醋酸透析72h,再用蒸馏水透析,直至加入硝

酸银后无沉淀为止,将样品进行冷冻干燥,用于

以后的分析试验.

1.3.5氨基酸组成分析 (1)样品水解:样品用6mol/L的盐酸112—

116℃水解24h,将样品真空干燥.

(2)水解样品的衍生:样品中加入20mmol/L

盐酸,预热至55℃,加入硼酸缓冲液,

混匀,再加入试剂,涡旋5—7S,放置1

min后,衍生结束.将样品加入自动进样瓶中,55

℃加热10min.

(3)氨基酸衍生物的分离,在高效色谱中进行,

色谱柱:AccQ—TagColum;固定相:C18;流动相:

AccQ—TagA液.

(4)用Waters2475扫描荧光检测器.激发波

长250nm,发射波长395nm.

1.3.6SDS—PAGE凝胶电泳

1.3.7蛋白质的差热分析

在测定过程中,升温速度10~C/min,氮气流速

40ml/min.

1.3.8酶解试验

准确称取ASC,PSC各0.005g,加入1.0ml

Tris—maleate,取0.1ml样品加入0.1mlSDS和

0.15mg/ml蛋白酶K,终点加入100mmol/L苯甲

基磺酰氟(PMSF)10l混匀,进行SDS—PAGE电

泳. 2结果与讨论

2.12种胶原蛋白的得率

脱钙后的鱼鳞按1.3.2和1.3.3的方法提取

得ASC和PSC,得率及性状见表1.由于鱼鳞胶原

蛋白以非常紧密的形式排列成胶原纤维,若干条胶

原纤维再聚集形成纤维束,进而形成纤维板结构,

而且又与鱼鳞硬蛋白紧密结合在一起,因此单纯依

靠酸的作用很难把结合态的胶原原纤维拆开,而使

胶原游离出来.加入胃蛋白酶后,由于蛋白酶对胶

原纤维两端的非螺旋区域进行水解,有利于胶原从

被束缚的纤维中游离出来,可以将酸不能溶解的蛋

白质提取出来,提高胶原蛋白的得率.

表1胶原蛋白的得率和感官差异

在后期回收胶原蛋白的过程中,ASC和PSC均

采用盐析,离心的方法,在试验中发现,这种方法使

蛋白的损失严重,在PSC的提取过程中,虽然提取

液中蛋白浓度较高,但经过2次盐析,离心再冻干

后,会使胶原蛋白得率降低很多.因此提高后期胶

原蛋白的回收率是目前一个亟需解决的问题.

2.2胶原蛋白ASC和PSC的氨基酸组成分析

鱼鳞ASC和PSC的氨基酸组成见表2.

表2鱼鳞ASC和PSC的氨基酸组成 注:/表示来检测到.

由表2可见,ASC和PSC具有与小牛皮胶原蛋

白氨基酸组成相似的特征:甘氨酸,脯氨酸,羟脯氨

酸的含量丰富,丙氨酸,天冬氨酸,谷氨酸含量较

高;色氨酸,酪氨酸,胱氨酸含量低,其中色氨酸,胱

氨酸未检测到.

ASC与PSC与小牛皮胶原蛋白氨基酸组成相

比,并不完全相同,羟脯氨酸的含量低,具有水产胶

原蛋白特有的性质,因而普遍具有较低的变性温

度.由于鱼鳞中胶原蛋白是与鱼鳞硬蛋白缔合在

一

起的,对于鱼鳞硬蛋白曾经有报道,称其氨基酸

组成与胶原蛋白的氨基酸组成非常相似,也有人认

为鱼鳞硬蛋白本身也是胶原蛋白,在Hiroyuki等

研究中不区分胶原蛋白和鱼鳞硬蛋白,而是把脱钙

第8期段蕊等:鲤鱼鱼鳞胶原蛋白ASC与PSC的比较

之后的鱼鳞整体作为胶原蛋白来处理,而这也可能

是鱼鳞胶原蛋白与其他胶原蛋白在氨基酸组成上

差异的原因.

2.3ASC和PSC的SDS凝胶电泳

将从冬季和夏季鱼鳞中得到的ASC和PSC分 别记为XA(夏季鱼鳞ASC),xP(夏季鱼鳞PSC),DA

(冬季鱼鳞ASC),DP(冬季鱼鳞PSC),取0.5mg溶

解于0.5mol/L的醋酸中,加人SDS样品处理液,按

2.3.6的方法,进行电泳,电泳后的结果见图1.

y—l

B一

≯

蔼

XAXPDADP

图1鱼鳞胶原蛋白的电泳

由图1可清楚看出,各种胶原蛋白均走出了几

乎相同a带,p带,带,其中a又包含a,,a:,且a,

带的颜色较a:带深,说明a,的含量较a:多,可以得

到鲤鱼鱼鳞胶原蛋白含有2条不同的a链,及2条

a组合在一起形成的B链的结论,从图谱分析来推

测鱼鳞中胶原蛋白属于I型,ASC与PSC的分子组

成均为[a]:a2,从电泳图谱上很难看出ASC与

PSC存在差异.不但a,,a:带,p带相似,甚至由多

条a链组成的多聚体链也完全相同.

对于鱼鳞的组成中,主要组成成分是蛋白质,

蛋白质又主要由胶原蛋白和鱼鳞硬蛋白构成,而硬

蛋白的组成与胶原蛋白也非常相似,PSC与ASC的 区别只是在提取方法上存在不同,即PSC是经过蛋

白酶有限水解胶原非螺旋区域后的产物.在I型

胶原蛋白中,非螺旋区域相对于螺旋区域相比相对

较小,在氨基酸组成上在某些蛋白质上存在一定差

异,但在SDS凝胶电泳图中则无法反映出来.

2.4ASC和PSC经蛋白酶K有限水解的电泳

通过以上试验,难以看出PSC与ASC的区别,为

了进一步说明两种胶原蛋白在氨基酸组成上存在的

—

致性,用蛋白酶K进行有限水解,比较得到的肽段

的异同.可以设想,如果PSC与ASC的一级结构是

相同的,经过蛋白酶K有限水解后的片段也是相同

的,如果得到的片段存在区别,则说明两种蛋白在氨

基酸组成上存在差异,水解后的结果见图2.

l2345

图2ASC和PSC经过蛋白酶K水解的电泳

注:1.未水解ASC对照;2,3:ASC;4,5:PSC

由图2可见,ASC和PSC水解后,胶原蛋白的

二倍体及单体完整胶原蛋白链基本消失或已经

非常少,分解成若干的短肽,但ASC和PSC的片段

从图谱对应的位置看,几乎完全相同,无论冬季还

是夏季,两种胶原蛋白之间在蛋白酶K水解片段图 谱上是相同的,难以发现两类蛋白质经过蛋白酶K

有限水解后产物的不同,这也说明两类蛋白质的结

构和构型上的一致性.

2.5差热分析(DSC)结果

DSC测量的是材料内部与热转变相关的温度,

热流的关系,反应了原料本身的特性,如玻璃化转

变温度,冷结晶,相转变,熔融,结晶,产品稳定性

等.为了研究不同工艺得到的胶原性质的差别,以

两种胶原蛋白为原料,按1.4.7的方法进行测试,

具体结果见图3.

由图3可见,对于不同的胶原蛋白,稳定性是

不同的.由于本研究采用冻干样品,吸收峰的位置

推测为胶原蛋白内部水分子的解离造成的,或在较

低的水分含量下,蛋白质分子高级结构发生改变的

结果,由水分子从胶原蛋白游离的难易程度可以判

断胶原蛋白分子内部氢键的结合情况,以及胶原蛋

白分子的变性程度.

由图3可见,对于ASC,热吸收峰的位置在

102.3℃,而且在最大吸收峰的两侧出项一系列的

小峰,表明胶原蛋白中氢键的破坏,蛋白质分子变

性过程有不同的阶段.PSC热吸收峰位置的温度

比ASC降低了很多(60.45℃),由此可见,尽管胃 蛋白酶对胶原蛋白的非螺旋肽段起作用,对螺旋区

域影响不大,但蛋白质分子的细微改变也会大大影

响整体胶原蛋白的稳定性,也说明非螺旋区域对于

水分子的滞留起到了非常关键的作用.如果以胶

原蛋白作为保水剂的原料,在对分子内水分保持的

性能上,ASC要远远优于PSC.此外,从吸收热量

的数值来看,对于ASC为36.32J/g,而PSC的吸热

一

叠一

水产科学第27卷

量只有12.89CalZg,单位质量胶原蛋白的吸热量也

减少了1倍多.

●

鼍

《

群l

0

0

Zl/℃

ASC 7./℃

PSC

图3不同胶原蛋白的DSC曲线

40.o0

3结论

在试验中,对于鱼鳞胶原蛋白ASC和PSC,蛋

白之间在分子构型,氨基酸组成等方面的差异不明

显,经过SDS一凝胶电泳和氨基酸分析以及蛋白酶

K有限酶解以后的图谱证明了这一点,但从DSC来

看,二者之间在热稳定性方面存在不同.PSC对热

的耐受性比ASC低,推测差距产生的原因与蛋白质

制备过程中,蛋白酶的作用有关,胶原蛋白两端的

非螺旋区域受到酶的作用而分解,非螺旋区域对三

螺旋的稳定性起着重要作用,非螺旋区域的分解大

大降低了PSC对热的耐受性.

致谢:

本研究得到了江苏省海洋生物重点实验室和日本学术

振兴会(JSPS)的资助,在此表示衷心的感谢.

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ComparisonbetweenAcid-solubleandPepsin-soluble

CollagenfromFishScalesofCommonCarp

DUANRui,ZHANGJun-jie,KONNOKunihiko (uKeyLaboratoryofMarineBiotechnology,CollegeofMarineScience,HuaihaiInstituteofTechnology,Han-yungang

222005,China;yofFisheries,HokkaidoUniversity,41~611Japan)

Abstract:ThescalesofcommoncarpCyprinuscarpio,productinfisheryproductprocessing,wasemployedasraw

materialstoextractcollagenbytwomethods,ultsshowedthatthedifference

betweenacid—solublecollagen(ASC)andpespinsolublecollagen(PSC)wasnotsignificantbyaminoacidandSDS—

pageanalysis,andthatthethermal—ferencemaybecausedbyhy—

drolysisofnon—helixpeptidewhichisveryimportanttothethermal—stabilityofthree—rolysis

ofnonhelixpeptidereducedthethermalstabilityofcollagengreatly.

Keywords:commoncarp(Cyprinuscarpio);fishscale;acidsolublecollagen;pepsinsolublecollagen

(责任编辑:晓荷)

葛堆