肝癌干细胞研究进展与方向_徐文

2024年1月12日发(作者：)

1004《癌症》ChineseJournalofCancer，2009，28（9）：1004－1008肝癌干细胞研究进展与方向徐文，曹璐，殷正丰WenXu，LuCaoandZheng-FengYin综·述·Progressandprospectsincancerstemcellresearchforhepatocellularcarcinoma［Abstract］Thecancerstemcell（CSC）theorystipulatesthatitisasmallandpossesspopulationofcellscalledCSCsthatinitiatestumorformationandmaintainsitsgrowth．CSCsarescarcewithinthebulkofthetumormass，stemcell-likepropertiessuchasself-renewal，differentiationandresistanceincludingCD133，totherapies，andsoon．Inthepastfewyears，byusingsidepopulationtechniqueandapproachesbasedonsurfacemarkers，CD90，OV6andEpCAM，researchershaveidentifiedandisolatedasubpopulationoflivercancercellswithenhancedcolony-formingandtumorigenicability，whichisstrongevidencefortheexistenceofliverCSCs．Inthisreview，wesummarizedtheprogressofresearchonliverCSCs，discussedthesignificanceofliverCSCsinthediagnosisandtreatmentofhepatocellularcarcinomas，andputforwardthefutureresearchdirectionsas第二军医大学东方肝胆外科医院分子肿瘤实验室，上海200438【摘要】近年来随着“干细胞”的概念被引入肿瘤学研究，肿瘤干细胞学说逐wellasthechallengesandopportunities．Keywords：hepatocellularcarcinoma，cancerstemcells，stemcellsDepartmentofMolecularOncology，EasternHepatobiliarySurgeryHospital，SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai，200438，P．R．China通讯作者：殷正丰渐形成。该学说认为，导致肿瘤发生和维持肿瘤生长的是一小群叫做“肿瘤干细胞”的细胞；这些细胞在肿瘤组织中数量极少，具有自我更新、分化及抗治疗能力等干细胞样特性。在过去的数年中，研究者分别通过侧群细胞技术及CD133、CD90、OV6、EpCAM等标志鉴定和分离得到具有很强的体外克隆形成及体内成瘤能力的小群肝癌细胞，为肝癌干细胞的存在提供了有力证据。本文对肿瘤干细胞理论和肝癌干细胞相关研究进展进行了综述，对肝癌干细胞在肝癌诊断和治疗方面的重要性进行了讨论，并对我们面临的有关挑战、机遇和未来的研究方向进行了分析。关键词：肝细胞癌；肝癌干细胞；干细胞；肿瘤干细胞中图分类号：R735．7文献标识码：A文章编号：1000－467X（2009）09－1004－05近年来，随着“干细胞”的概念被其余绝大部分肿瘤细胞只具有相对的增殖能力，经过有限的增殖和分化阶段后最终走向死亡。肿瘤干细胞学说不仅为肿瘤发生、发展和转移机制的研究带来新的思路，而且为肿瘤临床诊断和治疗带来新的希望，是肿瘤学领域具有划时代意义的全新理论。至于肝细胞癌（hepatocellularCorrespondenceto：Zheng-fengYinTel．：86．21．81875351Fax：86．21．81875351Email：yinzfk＠yahoo．com．cn基金项目：国家“863”项目（No．引入肿瘤学研究，以及多种肿瘤干细胞得到分离和鉴定，肿瘤干细胞（cancerstemcells，CSCs）学说逐渐形成。这一学说认为，与正常组织一样，肿瘤组织由处于各种不同分化程度的细胞组成，其中有一小群干细胞样细胞，即所谓“肿瘤干细胞”，具有自我更新和无限增殖能力以及多向分化潜能，是肿瘤形成的起始细胞并维持肿瘤的持续生长，也称为“肿瘤起始细胞”（tumor-initiatingcells，2007AA02Z461），国家自然科学基金项目（No．30672002，30801342）Grants：NationalHigh-TechResearchandDevelopmentProgramofChina（No．2007AA02Z461）；NationalNaturalScienceFoundationofChina（No．30672002，30801342）收稿日期：2008-12-18修回日期：2009-04-15carcinoma，HCC）与干细胞关系的研究则由来已久。随着肿瘤干细胞理论的提出，肝癌干细胞也成为研究热点，吸引了国内外许多学者浓厚的研究兴趣，并且新近取得了一些值得关注的研究结果。TICs），在肿瘤的发生、进展、转移、复发中起关键作用［1，2］。而肿瘤组织中

徐文，等．肝癌干细胞研究进展与方向1005尽管SP法被广泛用于鉴定肿瘤干细胞，然而该法有其局限性，理由如下：Hoechst33342有细胞毒性，SP细胞因具有膜转运能力而受到保护，而非SP细胞因得不到这种保护而被细胞毒性伤害，可能因此无法成瘤。故SP细胞和非SP细胞成瘤能力的不同很可能是由于Hoechst33342的毒性作用造成的假象，而非真正的“干性”差异引起的［22］。相反地，可考虑用表达于SP细胞表面的ABCG2替代SP细胞作为肝癌干细胞标志。11．1肿瘤干细胞理论肿瘤干细胞理论的提出早在150年前，病理学家就发现2肝癌干细胞存在的证据已有一些研究［15－18］提示肝癌干细胞（livercancerstemcells，LCSCs）的存在，因为与许多其他类型的肿瘤一样，肝癌也是由具有自我更新和分化潜能等干细胞特征的肝癌细胞亚群产生和驱动的。卵圆细胞是一种肝干／前体细胞，可分化为肝细胞及胆管细胞。利用大鼠混合型肝细胞-胆管细胞癌组织建立的CC-62细胞系表达白蛋白、CK-7、CK-肿瘤组织与胚胎组织之间存在相似性，于是提出了肿瘤来源于胚胎样组织的假设。20世纪60年代，研究人员把系列稀释的小鼠白血病细胞移植到同系的小鼠体内，发现移植的癌细胞仅有1％～4％能够形成脾内克隆［3］。1994年报道的具有CD34＋CD38－表型的人急性髓性白血病（humanacutemyeloidleukaemia，19、OV-6等卵圆细胞标志，并可在裸鼠体内成瘤［19］。这是鉴定肝癌干细胞的首次尝试。侧群（sidepopulation，SP）细胞是用流式细胞仪分选出来的一群因表达膜转运蛋白ABCG2（adenosineCD133是公认的造血干细胞和神经干细胞标志，并被认为是脑和前列腺肿瘤干细胞标志物［6］。近年来，多个研究小组从人肝癌细胞系中分离和鉴定了CD133＋表型的肝癌干细胞［23－25］。AML）干细胞是人类恶性肿瘤干细胞的首次发现［4］，之后很快得到其他报道［5］的验证。2001年Reya等［1］通过对造血干细胞与血液系统肿瘤研究的回顾，提出了完整的肿瘤干细胞学说，并且推测肿瘤干细胞不仅存在于血液系统肿瘤中，还存在于众多实体瘤中。triphosphate-bindingcassette，sub-familyG，member2）而能泵出Hoechst33342染料从而呈淡染的细胞。近年来多项研究显示肿瘤细胞系和原代肿瘤组织中的SP细胞具有肿瘤干细胞样特性。Ma等［25］研究发现，与CD133－肝癌细胞相比，CD133＋肝癌细胞具有更强的克隆形成和增殖能力。免疫组化检测发现，CD133＋细胞少量存在于人肝癌标本、配对的非肿瘤肝组织和硬化肝组织中，而不存在于正常肝组织中。这一结果与以往肿瘤干细胞在整个肿瘤组织中比例不超过5％的报道相一致。体内实验显示，1×103个CD133＋肝癌细胞即可在NOD／SCID小鼠体内成瘤。移植瘤中的大部分细胞为CD133－细胞，而CD133＋细胞少于1％。这与人肝癌标本中的情况相似。CD133＋肝癌细胞还可在体外被诱导分化成非肝细胞，而CD133－细胞则不具有这种分化能力。基因分析结果显示，CD133＋肝癌细胞高表达与干细胞自我更新、增殖等特性相关的基因，如β-catenin、Oct-3／4、1．2实体肿瘤干细胞存在的证据目前已有广泛证据证实实体瘤中Chiba等［20］分析了4种人肝癌细胞系，结果在Huh7和PLC／PRF／5细胞中分离到了SP细胞，而在HepG2和Huh6细胞中未发现SP细胞。免疫组化检测发现，大部分SP细胞同时表达肝细胞和胆管细胞标志蛋白。体外实验显示，这些SP细胞有很强的克隆形成能力和抗凋亡能力。体内实验显示，1×103个SP细胞即可在NOD／SCID小鼠体内形成移植瘤，而1×106个非SP细胞不能成瘤。分析发现，SP细胞可产生肿瘤干细胞的存在［6］。2003年研究人员第一次从实体瘤内分离出肿瘤干细胞。Al-Hajj等［7］利用流式细胞仪从乳腺癌细胞中分选出CD44＋CD24－／low细胞，200个该表型细胞即可在非肥胖型糖尿病／重症联合免疫缺陷（non-obesediabetic／severecombinedimmuno-deficiency，NOD／SCID）小鼠体内形成移植瘤，且可在其体内连续传代。每次形成的移植瘤内均既含有CD44＋CD24－／low细胞，又含有原发瘤中不具成瘤性的其他表型的肿瘤细胞。几乎在同时，Singh等［8，9］从一系列脑肿瘤组织中分选出CD133＋的肿瘤细胞，其体外生长特征与正常神经干细胞相似，能够自我更新和增殖，并可在体外被诱导分化成与原发瘤表型相似的肿瘤细胞。而在NOD／SCID小鼠体内只需种植100个CD133＋肿瘤细胞即可成瘤，且所形成移植瘤的表型与原发瘤相同。随后众多研究小组相继在肺癌［10］、前列腺癌［11］、胰腺癌［12］、结肠癌［13］、子宫内膜癌［14］等一系列实体肿瘤组织中发现了肿瘤干细胞，有力支持了肿瘤干细胞学说。SP和非SP细胞，且只有SP细胞继承成瘤能力。基因芯片分析发现，与非SP细胞相比，SP细胞中有数个干细胞基因表达上调，而这些基因对于维持干细胞功能和表型特征非常关键。基于上述结果，研究者认为其分离到的SP细胞即为人肝癌干细胞。Shi等［21］在4种肝癌细胞系（HCCLM3、MHCC97-H、Bmi、SMO和Notch-1等，而这些基因也参与肝癌相关的信号通路。研究者们对肝癌患者肿瘤组织内CD133＋肝癌细胞存在的临床意义亦作了初步探讨。Song等［26］发现CD133＋肝癌细胞的比例升高与肝癌患者血清甲胎蛋白升高、较高的肿瘤病理分级及较差的预后呈正相关。而另一项研究则显示MHCC97-L和Hep3B）中也分离到了SP细胞，并且发现各种肝癌细胞系中SP细胞的比例高低与该细胞系本身的转移能力成正相关。这些SP细胞在体外均具有自我更新能力、高克隆形成潜能和显著的抗化疗特性，2×103个SP细胞即可在NOD／SCID小鼠体内形成肿瘤。CD133＋肝癌细胞的数量与肝癌患者的临床病理分级并无相关性［27］。这意味着CD133＋肝癌细胞的存在情况作为肝癌预后指标尚需进一步的证据。然而，CD133＋细胞在许多肝癌细胞系中并未检测到［23，25］，而在Huh7肝

1006癌细胞系中CD133＋细胞比例则达到徐文，等．肝癌干细胞研究进展与方向疗手段有效与否一般都是以肿瘤的消退或者缓解为标准。根据肿瘤干细胞理论，肿瘤中绝大多数细胞只具备有限增殖能力，消灭这些细胞虽然能使肿瘤消退或缓解，但是治疗如果不能杀死导致肿瘤形成并维持肿瘤生长的肿瘤干细胞，那么肿瘤仍会复发。故对肿瘤的治疗应针对肿瘤干细胞［38］。与其他肿瘤干细胞一样，肝癌干细胞也表达ABCG2等耐药相关蛋白［21］，且大部分时间处于静止期，而传统化疗药物主要针对处于细胞周期中快速增殖的肿瘤细胞。这就部分解释了为什么化疗药物无法杀灭全部肿瘤细胞从而难以避免复发的现象。因此，有必要深入研究肝癌干细胞的生物学特性，寻找肝癌干细胞特异的分子标志物和信号通路，为针对肝癌干细胞的靶向治疗提供思路，从而使原发性肝癌的治疗现状发生根本性改变。肿瘤干细胞学说对于肝癌的诊断、预后判断及治疗方案的确定也具有重要意义。临床研究显示，约30％的乳腺癌患者临床确诊时可在骨髓中检测到播散的乳腺癌细胞，但是5年后这些患者中只有50％左右有骨转移的临床表现，也就是说有相当一部分骨髓中检测到播散肿瘤细胞的患者最终并没有形成明显的骨转移灶［7］。根据肿瘤干细胞理论，一个可能的解释是，这些不形成转移灶的患者骨髓中的播散肿瘤细胞中不存在肿瘤干细胞，而只有当肿瘤干细胞发生播散时才会形成转移。推测肝癌患者中也可能存在类似现象，并且得到一些研究结果［23，24］的初步支持。因此，寻找肝癌干细胞特异、敏感的标志物，开发相应的播散肝癌干细胞诊断试剂，用于检测肝癌患者的血液、骨髓内是否存在播散的肝癌干细胞，可以更准确地预测哪些肝癌患者可能发生转移和／或复发，并制定更合理的个体化治疗方案。特征和相关信号通路等方面。Ma等［32］发现，CD133＋肝癌细胞的耐药性是通过激活AKT／PKB和Bcl-2生存信号通路来实现的，提示通过阻断上述通路可能会提高肝癌对化疗的敏感性。65％，在Hep3B中更是高达90％［25］。并且，CD133－肝癌细胞也具有免疫缺陷小鼠体内成瘤能力，尽管所需要的细胞数较多［25］。另据Ho等［28］报道，CD133也是肝癌患者体内循环内皮细胞（circulatingendothelialprogenitorYamashita等［33－35］报道了Wnt／β-catenin通路在调节正常肝干细胞和肝癌干细胞自我更新能力方面的作用。该研究小组认为，cells，EPCs）的标志。由此看来，CD133作为肝癌干细胞标志物尚存在敏感性和特异性方面的问题。Ma等［29］采用二维电泳和质谱技术鉴定出醛脱氢酶（aldehydedehydrogenase，ALDH）特异表达于CD133＋肝癌细胞，而不表达于EpCAM＋（epithelialcelladhesionmolecule）肝癌细胞具有肝癌干细胞的所有特性，EpCAM是Wnt／β-catenin通路的靶基因，阻断Wnt／β-catenin通路可使EpCAM＋肝癌细胞增殖受到抑制。国内Yang等［36］利用肝前体细胞标志物OV6从肝癌细胞系中分离出OV6＋细胞，发现OV6＋肝癌细胞比CD133－肝癌细胞；并发现CD133＋肝癌细胞群具有异质性，ALDH只在其中一部分细胞中表达，且CD133＋ALDH＋肝癌细胞成瘤能力显著强于CD133＋OV6－肝癌细胞具有更强的体内成瘤能力和抗化疗能力，并证明了Wnt／β-ALDH－肝癌细胞，提示CD133＋ALDH＋是比CD133＋更特异的肝癌干细胞候选表型。catenin通路的活化对于OV6＋肝癌细胞的自我更新和抗化疗能力起关键作用。以上研究提示，阻断Wnt／β-catenin通路的治疗可能有助于提高肝癌疗效。此外，Tang等［37］报道，TGF-β通路失活和／或IL-6信号通路活化可引起分化障碍和肝癌形成。Yang等［30，31］的研究显示，CD90可能是另一个重要的肝癌干细胞候选标志物。从人肝癌细胞系分离到的CD90＋细胞可在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤，且各种肝癌细胞系中CD90＋细胞比例与该细胞系的成瘤性和转移能力呈正相关。在所有肝癌标本及91．6％的肝癌患者血样本中分离到了CD45－CD90＋细胞，并且这些细胞均可在免疫缺陷小鼠体内成瘤。肝癌组织中CD45－3肝癌干细胞研究的意义首先，肿瘤干细胞理论更新了人们对肝癌发生、发展、转移、复发的理解。研究者一直试图揭示肿瘤发生的分子和细胞机制。随着过去的30年干细胞生物学研究的不断进步以及近年来肿瘤干细胞研究的不断深入，人们逐渐认识到肿瘤可能是一种干细胞疾病。肿瘤干细胞是肿瘤形成的起始细胞并维持肿瘤的生长，而肿瘤中绝大多数细胞不能自我更新，经过有限的增殖之后最终走向死亡。因此，后者的播散可能不会导致肿瘤的转移、复发。而肿瘤干细胞才是肿瘤转移、复发的根源。近年来关于肝癌干细胞存在的证据不断被发现，人们更有理由推测肝癌可能也是一种干细胞疾病。其次，肿瘤干细胞学说对肝癌传统治疗理念带来巨大冲击。肝癌手术后转移复发率高，且对放疗、化疗不敏感，远期疗效差。目前临床上对肿瘤的治疗都是针对全部肿瘤细胞，评价治CD90＋细胞数目和配对血标本中CD45－CD90＋细胞数目呈显著正相关。从移植瘤内分离到的CD90＋细胞可在免疫缺陷小鼠体内二次成瘤及三次成瘤。进一步研究发现，CD90＋CD44＋细胞恶性程度比CD90＋CD44－细胞高，可在免疫缺陷小鼠的肝脏原位成瘤并形成肺转移瘤。应用CD44抗体阻断CD44活性，可诱导CD90＋细胞体外凋亡，并抑制CD90＋细胞在免疫缺陷小鼠体内成瘤。以上实验结果提示，CD90是一个较理想的肝癌干细胞候选标志物，而CD44是针对CD90＋肝癌干细胞的潜在治疗靶点。鉴于这些研究工作预示的重要意义，目前国内外一些实验室正在验证并试图扩展有关研究结果。继近年来鉴定和分离肝癌干细胞的成功尝试之后，数个研究小组已将研究扩展到分析肝癌干细胞的生物学4存在的问题及研究方向总的来说，与其他类型实体瘤的肿瘤干细胞研究相比，目前肝癌干细胞的研究进展还比较少，人们对肝癌干细胞的认识也仅限于少数几篇文献报道，甚至由于尚未获得令人信服的

徐肝癌干细胞分离与鉴定结果，肝癌干细胞存在的证据尚受到一些质疑。即便是已报道的研究结果，也有待更多实验室的验证。鉴于至今尚未有公认的肝癌干细胞标志物，当前亟待解决的问题是确定肝癌干细胞特异性标志物，以此为基础建立分离、鉴定和培养肝癌干细胞的标准技术体系。虽然目前已有SP、［2］［1］文，等．肝癌干细胞研究进展与方向（2）：75－80．1007［12］LiC，HeidtDG，DalerbaP，etal．得到评价，这对于肝癌诊断、治疗、预后判断等都具有重要意义。Identificationofpancreaticcancerstem［参考文献］cells［J］．CancerRes，2007，67（3）：1030－1037．［13］O'BrienCA，PollettA，GallingerS，ReyaT，MorrisonSJ，ClarkeMF，etal．Stemcells，cancer，andcancerstemcells［J］．Nature，2001，414etal．Ahumancoloncancercell［J］．（6859）：105－111．capableofinitiatingtumourgrowthinimmunodeficientmiceNature，2007，445（7123）：106－110．［14］FrielAM，SergentPA，PatnaudeC，PardalR，ClarkeMF，MorrisonSJ．Applyingtheprinciplesofstem-cellbiologytocancer［J］．CD133＋、CD90＋、EpCAM＋、OV6＋等作为肝癌干细胞表型的报道，甚至有人认为Huh7细胞系中的G0期细胞为肝癌干细胞［39］NatRevCancer，2003，3（12）：895－902．［3］etal．Functionalanalysesofthetumorinitiating，但这些候选表型均各有其［21，22，25，30］BergsagelDE，ValerioteFA．Growthcharacteristicsofamouseplasmacelltumor［J］．cancerstemcell-likepropertiesofhumanendometrial242－249．［15］AlisonMR．Livercancer：adiseaseof特异性或敏感性等方面的不足或需要更多的实验验证。在上述候选标志分子中，报道认为仅有CD90与CD133有交叉表达［30］。而Yamashita等［35］发现，EpCAM＋和EpCAM－的Huh1肝癌细胞CD133表达情况没有差异，但只有EpCAM＋细胞具有成瘤能力，而［4］CancerRes，1968，28cells［J］．CellCycle，2007，7（2）：（11）：2187－2196．LapidotT，SirardC，VormoorJ，etal．AcellinitiatinghumanacutemyeloidleukaemiaaftertransplantationintoSCIDmice［J］．Nature，1994，367（6464）：645－648．stemcells？［J］．PanminervaMed，2006，48（3）：165－174．［16］WuXZ，YuXH．Bonemarrowcells：thesourceofhepatocellularCD90只在EpCAM－AFP－的肝癌细胞系中表达。面对如此让人困惑的现象，一个可能的解释是，不同的肝癌干细胞标志分子可能代表了肝癌干细胞的不同分化阶段［40］；另有相似观点认为，肝癌干细胞所起源的正常干细胞中被激活的信号通路的不同，导致了肝癌干细胞所表达标志物的不同［35］。这些问题值得进一步深思和探索。除此之外，今后肝癌干细胞研究需重点解决以下关键问题：①鉴定肝癌干细胞与肝干细胞的关系。肝干细胞的研究由来已久。目前认为，肝脏是一个增殖分化并不旺盛的组织器官，肝干细胞只有在肝脏受到严重的慢性损伤的情况下才可能出现。目前对肝癌干细胞的起源尚有不同观点。显然，鉴定肝癌干细胞是否起源于肝干细胞，以及鉴定可能涉及干细胞的肝癌发生发展的机制无疑具有十分重要的意义。②鉴定肝癌干细胞不同于正常肝干细胞和肝癌细胞的生物学特点以及信号转导通路。③鉴定肝癌干细胞的耐药性并阐明其机制。④针对肝癌干细胞的治疗措施的研发。相信随着研究的深入，肝癌干细胞特异性标志物及相关信号转导通路将会被发现，肝癌干细胞在肝癌的发生、发展、转移、复发及预后中扮演的关键角色将［5］BonnetD，hierarchyDickJE．thatHumanacutefromacarcinoma？［J］．MedicalHypotheses，2007，69（1）：36－42．［17］HeYF，myeloidleukemiaisorganizedasaoriginatesprimitivehematopoieticcell［J］．NatMed，1997，3（7）：730－737．［6］倪晓光，赵（6）：775－778．［7］平．实体瘤肿瘤干细胞的研究进展［J］．癌症，2006，25LiuYK，mouseliverLuHJ，etal．ofComparativeprimaryproteomicanalysisc-Kit-（CD45／TER119）-stem／progenitorcells［J］．JCellBiochem，946．［18］ChibaT，ZhengYW，KitaK，etal．2007，102（4）：936－Al-HajjM，HernandezA，identificationWichaMS，etal．oftumorigenicBenito-breastProspectiveEnhancedself-renewalcapabilityinhepaticstem／progenitorcellsdrivescancer937－950．［19］Gil-BensoR，cancercells［J］．ProcNatlAcadSciUSA，2003，100（7）：3983－3988．［8］initiation2007，［J］．Gastroenterology，133（3）：SinghSK，ClarkeID，TerasakiM，etal．Identificationofacancerstemcellinhumanbraintumors［J］．Martinez-LorenteA，CancerPellin-PerezA，etal．Characterizationofanewratcelllineestablishedfrom2'AAF-inducedcombinedhepatocellularcholangiocellularcarcinomaVitroCellDevBiolAnim，（1）：17－25．［20］ChibaT，KitaK，ZhengYW，etal．［J］．Res，2003，63（18）：5821－5828．［9］SinghSK，HawkinsC，ClarkeID，etal．Identificationofhumanbrain［J］．Intumourinitiatingcells［10］KimCF，Nature，2001，372004，432（7015）：396－401．JacksonEL，etal．WoolfendenofAE，Identification［J］．Sidepopulationpurifiedfrom［J］．bronchioalveolarstemcellsinnormallungandlungcancer2005，121（6）：823－835．［11］Kuzmanovhepatocellularcarcinomacellsharborscancerstemcell-likeproperties［21］ShiGM，Cell，Hepatology，2006，44（1）：240－251．XuY，FanJ，etal．Identificationofsidepopulationcellsinhumanhepatocellularcarcinomacelllineswith［J］．A，asHayrabedyanS，etal．Basalcellhuman［J］．KaraivanovM，subpopulationputativeprostatecarcinomastemcellsFoliaHistochemCytobiol，stepwisemetastatic2007，45potentialsJCancerResClin

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